Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation
Summary
Endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) sind entscheidend in der Neovaskularisation von ischämischen Geweben beteiligt. Dieses Verfahren beschreibt die Isolierung von menschlichem EPCs aus peripherem Blut sowie die Identifizierung ihres Migrationspotential gegen Serumproben von Herzchirurgiepatienten.
Abstract
Endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) aus dem Knochenmark unter pathologischen Bedingungen wie Hypoxie rekrutiert und sind in der Neovaskularisation von ischämischem Gewebe entscheidend beteiligt. Die Herkunft, Klassifizierung und Charakterisierung von EPCs sind komplex; Trotz zwei prominente Untertypen von EPCs festgelegt wurden: die so genannte "early" EPCs und spät Auswuchs EPCs (late-EPCs) (nachfolgend als Early-EPCs bezeichnet). Sie können während der in vitro – Kultur sowie durch ihr Aussehen durch biologische Eigenschaften klassifiziert werden. Während "früh" EPCs in weniger als einer Woche nach der Kultur der peripheren Blut stammenden mononukleären Zellen in EC-spezifischen Medien erscheinen, können Spät Auswuchs EPCs nach 2-3 Wochen gefunden werden. Spät Auswuchs EPCs wurden erkannt direkt in Neovaskularisation beteiligt zu sein, vor allem durch ihre Fähigkeit, sich zu reifen Endothelzellen zu differenzieren, während "früh" EPCs verschiedene angiogene Faktoren als endogen exprimierenous Ladung Angiogenese in einem parakrine Weise zu fördern. Während myokardialen Ischämie / Reperfusion (I / R), steuern verschiedene Faktoren, die die Homing von EPCs in Regionen von Blutgefäßbildung.
Makrophagen – Migration hemmenden Faktor (MIF) ist ein Chemokin-ähnliche pro-inflammatorischen und ubiquitär exprimiert Zytokin und wurde kürzlich als Schlüsselregulator der EPCs Migration funktionieren bei physiologischen Konzentrationen 1 beschrieben. Interessanterweise wird MIF in intrazelluläre Pools gespeichert und können schnell in den Blutstrom nach mehreren Stimuli (zB Myokardinfarkt) freigegeben werden.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die zuverlässige Isolierung und Kultivierung von Früh EPCs aus adultem menschlichem peripherem Blut basierend auf CD34-positive Selektion mit anschließender Kultur in Medium endotheliale Wachstumsfaktoren auf Fibronectin-beschichteten Platten für den Einsatz in in vitro Migrationsassays gegen Serumproben enthalten , von herzchirurgischen Patienten. Weiterhin ist dieMigrations Einfluss von MIF auf Chemotaxis von EPCs im Vergleich zu anderen bekannten Angiogenese-stimulierenden Zytokinen demonstriert.
Introduction
Endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) im menschlichen Blut zirkulierende und haben die Fähigkeit , sich in Endothelzellen zu differenzieren 2. Sie nehmen an der Vaskulogenese und sind in der Lage , den Schaden durch eine Entzündung und Ischämie / Reperfusions (I / R) Verletzungen auf verschiedene Weisen 3, 4 verursacht minimieren. Zum Beispiel zeigen EPCs erhöhten Mengen an intrazellulärem antioxidative Enzyme wie Katalase, Glutathionperoxidase oder Mangan – Superoxid – Dismutasen (MnSOD) 5. Die erhöhte Beständigkeit gegenüber oxidativem Stress ermöglicht EPCs 6 in Mikroumgebungen mit erhöhten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) nach ischämischer Verletzung zu funktionieren. Frühere Studien zeigten auch , dass die Anzahl von EPCs könnte vaskulären Reparatur korreliert werden , und dass eine reduzierte Anzahl von EPCs zirkulierende das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse vorhersagt 7,class = "xref"> 8. Allerdings hat eine klare Definition eines EPC noch nicht gefunden worden. Bis jetzt gibt es keine spezifische Zelloberflächenmarker oder konsistenten Phänotyp für EPCs und diese Zellen sind sehr selten im peripheren Blut 9. Eine menschliche EPC sollte als Umlaufzelle mit der Fähigkeit, in Betracht gezogen werden, um die Rekonstruktion des verletzten Endothel und neue Gefßstrukturen beizutragen.
Ein Weg zur Isolierung und Charakterisierung von EPCs ist durch Adhäsion an Fibronektin. Dadurch wird die Kapazität dieser Zellen verwendet , um eine bessere Haftung zu zeigen beschichteten Schalen an Fibronectin im Vergleich zu Typ 1 – Kollagen, beispielsweise 3, 10, 11. Jedoch fand andere , dass Zellen auf Fibronektin-beschichteten Schalen ohne vorherige oder weiteren Reinigungsschritt führt zu Kolonien einschließlich myeloiden Vorläuferzellen, Monozyten und T – Lymphozyten mononukleären Plattieren 12, 13, 14. Darüber hinaus wird in diesem Fall die Thrombozyten die mononukleären Zellen (MNC) Fraktion verunreinigen und somit die Plasmamembranproteine auf alle anhaftenden Zellen 15 übertragen.
Neben der Charakterisierung durch in vitro Adhäsionsassays, wird eine Kombination von verschiedenen Zelloberflächenmarker verwendet , um einen Zelltyp als EPC betrachtet zu beschreiben. In diesem Fall wird nach Fibronectin vermittelten Adhäsion werden die Zellen ihre endothelial-ähnlichen Eigenschaften analysiert betreffen. In diesem Verfahren werden die beiden endothelialen zellassoziierten Markern, acetylierte-low density lipoprotein (acLDL) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGFR-2, KDR), eine Rolle spielen. Endothelial – Zellen und Makrophagen wurden "Scavenger – Zellen – Weg" 16 genannt gezeigt , speziell acLDL in einem Prozess in Anspruch nehmen. Ein weiterer Markerprotein ist KDR als Haupt VEGF-Rezeptor auf EndothelzellenZellen 17. Wie jedoch EPCs im allgemeinen kultiviert werden in Medien mit endothelialen Wachstumsfaktoren und fötalem Kälberserum ergänzt, ist es möglich, dass Makrophagen, die auch eine Endothel-ähnlichen Marker könnte wurden Profil irrtümlicherweise isoliert, zeigen. Wie zuvor gezeigt, kultiviert , wenn in einem Endothel-konditioniertes Medium, exprimieren Makrophagen "Endothel-spezifischen" Proteine 18.
Im allgemeinen gibt es zwei Kategorien von EPCs in mehrere Subtypen, die im Blut gefunden werden kann oder in vitro kultiviert werden. Spät Auswuchs EPCs (late-EPCs) erscheinen nach 2-3 Wochen der Kultur. Diese Zellen sind integriert schneller in eine Monoschicht aus menschlichen Nabelvenen – Endothelzellen und kann Kapillarröhrchen 19 bilden. Außerdem "early-EPCs" so genannte etwa eine Woche und handeln in einer passiven Weise durch Bereitstellung von angiogenen Molekülen, wie vaskulären endothelialen Wachstums im Blut zirkulierenFaktor (VEGF) oder CXCL8 19. Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK) , zeigten eine signifikant geringere Mengen an early-EPCs im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne CAD 20. Interessanterweise zeigte die gleiche Gruppe höhere Mengen an late-EPCs im Vergleich zu einer Kontrollgruppe. Eine andere Studie zeigte , dass eine frühe-EPCs differenzierte EPCs von Apoptose unter oxidativen Bedingungen in einer parakrinen Weise 6 schützen. Deshalb ist der frühe EPCs könnten relevante Schutzwirkungen durch die Migration von anderen Zellen in einer Auto- oder parakrine Weise im peripheren Blut zur Verfügung stellen.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren early-EPCs zu reinigen , indem zuerst die PBMC-Fraktion aus menschlichem peripherem Blut isoliert und anschließend Isolieren von CD34 + Zellen aus der PBMC-Fraktion von unerwünschten Zellen dieser Zellsuspension zu entfernen. CD34 ist ein Marker, der für die Isolierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen verwendet wird 9 </sup>. Danach werden CD34 + Zellen, die auf Fibronectin-beschichteten Gewebekulturoberflächen. Nach drei Tagen wird das Medium gewechselt, wobei alle nicht-adhärente Zellen zu verlieren. Schließlich werden isoliert EPCs gefärbt, um die Aufnahme von acLDL und die Anwesenheit von KDR als Endothelzell-Marker zu verifizieren durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Als zusätzlicher Marker, wir plättchen endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1, CD31) analysiert, die auf Endothelzellen tritt auch auf.
Wiederherstellung von beschädigten oder myokardialen Gewebe durch verstärkte Rekrutierung von EPCs infarzierte gehört zu den intensivsten untersuchten Behandlungsstrategien bei kardiovaskulären Erkrankungen. Allerdings ist die Übersetzung von experimentellen Ergebnisse in die klinische Praxis immer noch eine Herausforderung, die komplexe zelluläre Wechselwirkungen im menschlichen Körper bei verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen gegeben. Darüber hinaus löst der myokardialen I / R-Verletzungen eine übermäßige Sekretion verschiedener Zytokine, Hormone und Wachstums fac toren, die das Homing von EPCs in Regionen von Blutgefäßbildung 13 steuern. Wie bereits gezeigt, CXCL8, stromal cell-derived Faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF und Makrophagen migration inhibitory factor (MIF) werden in Serumproben nach Myokard – I / R Schädigung 1 signifikant erhöht. Unter diesen Faktoren ist ein pleiotroper MIF Chemokin-ähnliche Cytokine mit überwiegend proinflammatorischen Eigenschaften. Im Gegensatz zu seinem historischen Namen, hat MIF pro-Migrationsfunktionen, als eine echte Chemokin auf verschiedenen Zelltypen handeln 1, 21, 22. MIF-vermittelten Zelleinstellungsverfahren haben zur Chemokin – Rezeptoren CXCR4 und CXCR2 in Verbindung gebracht worden, die MIF bindet an und aktiviert in einem nicht-verwandtes Weise 21. Bemerkens exprimieren EPCs beide dieser Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, die zusätzlich unter hypoxischen Bedingungen nach oben reguliert werden,ass = "xref"> 23, 24. Darüber hinaus schlägt Ansammeln Hinweise darauf , dass MIF hat eine Gesamt Herz-schützende Wirkung während des I / R Verletzung des Herzens 22, 25, 26. In diesem Zusammenhang hat es sich ferner gezeigt , dass MIF die Neovaskularisation bei hypoxischen Stress unterstützen kann , die von besonderer Bedeutung ist, wenn die begrenzte Wiederherstellungsmechanismen des verletzten Myokard 27 berücksichtigen. Zurück di – vitro – Studien und Experimente in der präklinischen Mausmodellen 4 erste Erkenntnisse über die Rolle von MIF in EPCs Rekrutierung zur Verfügung gestellt. Zu beachten ist , MIF ist auch ein prominentes Fracht – Protein von EPCs , die 28 innerhalb ischämischen Stellen während EPCs Rekrutierung freigesetzt werden können. Doch Studien im klinischen Umfeld insbesondere im Vergleich zu anderen (angiogene) Serum Zytokine bleiben schwer zu fassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der erste Teil dieser Studie umfasste die Isolierung von humanen EPCs aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden, eine umfassende Bewertung des Blutes der Herzchirurgie-Patienten zu ermöglichen. Daher wurde eine Dichtegradientenzentrifugation geführt, um die PBMC-Fraktion aus Plasma, Granulozyten und Erythrozyten zu trennen. Für die meisten der verunreinigenden Blutplättchen zu entfernen, wurde diese Zellfraktion zu kurz ausgesetzt und langsam Waschschritte 29, <sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
Riferimenti
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
