Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt<em> In Vivo</em> Model van gladde spiercel proliferatie en endotheliale functie
Summary
Restenosis na cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Een ideale therapie zou de proliferatie van gladde spiercellen (VSMC) verhinderen, terwijl het bevorderen van regeneratie van het endothelium. We beschrijven een model voor gelijktijdige beoordeling van VSMC proliferatie en endotheliale functie in vivo.
Abstract
Arteriële reconstructie, ofwel angioplastiek of bypass-operatie, omvat iatrogene trauma waardoor endotheliale verstoring en vasculaire gladde spiercellen (VSMC) proliferatie veroorzaakt worden. Gemeenschappelijke muizenmodellen bestuderen kleine vaten, zoals de carotis- en femorale slagaders. Hierin beschrijven we een in vivo systeem waarin zowel VSMC proliferatie als endotheliale barrière functie gelijktijdig in een groot vat kunnen worden beoordeeld. We bestudeerden het infrarenale aorta respons op letsel in C57BL / 6 muizen. De aorta werd gewond van de linker nierader naar de aorta bifurcatie door 30 transmurale verpletteringen van 5 seconden duur met een katoenstippel applicator. Morfologische veranderingen werden beoordeeld met conventionele histologie. Aorta wanddikte werd gemeten van het luminale oppervlak naar de adventitia. EdU-integratie en tellerverf met DAPI en alfa-actine werd gebruikt om VSMC proliferatie te demonstreren. Activatie van ERK1 / 2, een bekende moderator van intimale hyperplasievorming, was afschrikkelijkOntgonnen door Western Blot analyse. Het effect van ontsteking werd bepaald door immunohistochemie voor B-cellen, T-cellen en macrofagen . En gezichtsafdelingen van endothelium werden gesynchroniseerd met scan-elektronenmicroscopie (SEM). Endotheliale barriere functie werd bepaald met Evans Blue staining. Transmurale letsel leidde tot verdikking van de aorta wand. Deze verwonding veroorzaakte VSMC proliferatie, meest prominente bij 3 dagen na verwonding, en vroege activatie van ERK1 / 2 en verminderde p27 kip1 expressie. Schade leidde niet tot verhoogde B-cellen, T-cellen, of macrofagen infiltratie in de vat van het vat. Schade veroorzaakte deelement van de endotheliale cel en verlies van cel-celcontact. Schade resulteerde in een significant verlies van de endotheliale barrière functie, die na zeven dagen terug naar de basislijn kwam. Het murine transmurale stomp aorta schade model biedt een efficiënt systeem om zowel VSMC proliferatie als endotheliale barrière functie in een groot vat te bestuderen.
Introduction
restenose Volgende cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Alle revascularisatieprocedures worden geplaagd door restenose. Huidige strategieën ter voorkoming van restenose (drug-eluerende stents en geneesmiddelcoated ballonnen) remmen zowel vasculaire gladde spiercellen (VSMC) en endotheliale cel proliferatie (EC). Bijgevolg voorkomen deze interventies VSMC gemedieerde restenose, maar voorkomen ook de regeneratie van het endothelium. Zonder een intact endothelium, zijn patiënten verplicht te zijn op krachtige antiplatelet middelen om het risico op in situ trombose te verminderen met het risico op bloedingen complicaties. Een ideale therapie zou VSMC proliferatie remmen, terwijl het bevorderen van de regeneratie van het endothelium. Zo is er een noodzaak om tegelijkertijd de VSMC proliferatie- en endotheliale barrièrefunctie in n vivo te bestuderen.
Momenteel zijn er ernstigeAl muismodellen van restenose 1 . Deze modellen omvatten carotid ligatie en femorale arterie draad verwonding 2 . Aortische modellen omvatten stentplaatsing 3 , ballonbesering 4 en aorta-allograft 5 . Alle huidige modellen zijn beperkt. Carotidligatie genereert een doorstroming gemedieerde neointimale laesie en heeft geen endotheel letsel. Bovendien hebben zowel carotide- als femorale slagaders veel vallen minder cellagen dan menselijke vaten, waardoor hun translatiewaarde wordt beperkt. De aorta van de muis die ongeveer 1,3 mm in diameter is, is het enige vat dat een klinisch relevante (coronaire) menselijke slagader benadert (3).
Ondanks het translatiepotentiaal van muizen aorta modellen van ziekte, hebben huidige modellen beperkingen. Deze modellen vereisen geavanceerde microchirurgische vaardigheden en gespecialiseerde apparatuur zoals angioplastiekballonnen en stents. Hierin presenteren weEen nieuwe, reproduceerbare techniek om tegelijkertijd VSMC proliferatie te induceren en endotheliale barrièrefunctie te verstoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben de effecten van een muizen aorta verwondingsmodel gekenmerkt, dat resulteert in mediale hyperplasie en endotheliale barriere dysfunctie. Gedeeltelijke EC-detachering langs de aorta-intima leidde tot het verlies van cel-celcontact en het verhogen van celuitstulpingen. Corresponderend was de endotheliale barrièrefunctie significant aangetast, die de mitogeengevoelige signaleringstrajecten stimuleerde, wat leidde tot proliferatie van VSMC's en verdikking van de vatwand. De sterkten van dit model zijn dat het…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Hsia Ru-ching PhD, van de Electron Microscopy Core Facility van de Universiteit van Maryland School of Medicine, voor haar technische ondersteuning bij het verwerken van de scan elektronische microscopie monsters.
Materials
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
Riferimenti
- Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff’s elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation – kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
