Summary

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Published: April 19, 2017
doi:

Summary

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für die nackten Plasmid-DNA in Mäusehaut exprimiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist immunbezogenen Gene in Hautgewebe liefern die funktionelle Rolle eines spezifischen Gens in Hautentzündung zu beschreiben.

Abstract

Dysregulation der Immunantwort in der Haut ist mit zahlreichen menschlichen Hauterkrankungen in Verbindung gebracht. Ein direkte Übertragung von immunbezogenen Genen in Hautgewebe ist ein faszinierender Ansatz Immunmodulation von Hautentzündung in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein kostengünstiges Protokoll, die nackte DNA in Mäusehaut geliefert und führt zu einem Transgen-Expression. Das Verfahren wird geprägt „acufection“, bezeichnet ACU Punktur-vermittelter DNA trans fektion. Zur Durchführung acufection, Mäusehaut wurde zuerst mit DNA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend gespitzt leicht mit einem Bündel von Akupunkturnadeln infundiert die Aufnahme von DNA und Transfektion in Zellen zu erleichtern. Der Plasmid-DNA wird vermutlich durch die Keratinozyten und dendritischen Zellen (DCs) in der Haut und in dem Protein exprimiert aufgenommen. Mechanische Stich mit der Nadel per se nicht Hautschäden verursachen oder Keratinozyten – Aktivierung induzieren. Der Ausdruckdie transfizierten Gene wurde sowohl für 2 Tage nach acufection Transkriptions- und Translationsniveau in der Haut detektiert und gehalten bis 7 Tage. Das primäre Ziel für die Entwicklung dieser acufection Methode war eine zuvor nicht definiert Isoform von IL-15 zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahren wird eine alternativ gespleißte IL-15-Isoform mit teilweise deletierten Exon 7 (IL-15ΔE7) wurde in der Haut exprimiert und anschließend mit einem Toll-like-Rezeptor 7 (TLR7) -Agonisten, Imiquimod (IMQ) behandelt, um Entzündung zu induzieren. Acufection-lieferte IL-15ΔE7 in der Haut unterdrückt Keratinozytenproliferation, epidermale Dicke und neutrophile Rekrutierung in IMQ-induzierte Hautentzündung. Mit zunehmendem Interesse der Regulationsmechanismen der Hautentzündung bei der Identifizierung beschriebenes Protokoll hier bietet eine kostengünstige und vielseitige Alternative zu dem Genkanone System oder Microseeding zur DNA – Verabreichung in vivo. Es kann möglicherweise Entdeckung der Funktion eines neuen erlaubenGene in der Haut oder für neue Behandlung für Hautkrankheiten zu untersuchen.

Introduction

Die Haut ist die erste Linie der Verteidigung des Wirts. Keratinozyten (KCS) ist der Hauptzelltyp in der Haut von Menschen und Mäusen. Als Reaktion auf Umweltreize (zB Sonnenlicht, Sauerstoff, Chemikalien und pathogene invasion) wird KCs aktiviert , und eine Vielzahl von proinflammatorischen Zytokine und Chemokine, wie IL-8 produzieren, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α und GM-CSF – 1. Gemeinsam lösen sie die Rekrutierung von Immunzellen auf der Haut. VERSCHLIMMERT kutanen Entzündung ist oft mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen , einschließlich akut ectopic Kontaktdermatitis und chronischen T – Zell-vermittelte Entzündung (zB allergische Kontaktdermatitis und Psoriasis) 2 verbunden. proinflammatorischen Reaktionen in der Haut modulierenden durch KC Aktivierung Hemmung ist ein plausibler Ansatz Hautentzündung zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz zur transient ein Zytokin-Gen in den Epidermis, um auszudrücken Immun res zu studierenponse Folge einer solchen Behandlung in der Haut.

Die Epidermis bildet die oberflächliche Schicht der Haut. Es dient als physikalische Barriere zu halten externe Substanzen, wie Nukleinsäuren und Pathogenen aus den tieferen Schichten der Haut eintritt. Mehrere nadelfreie Techniken wurden für DNA – Transfer epidermalen 3, 4 aufgebaut. DNA in Lösung oder in Verbindung mit kationischen Liposomen oder Adenovirusvektoren wurde an die Epidermis mit Techniken modifiziert wie die Entfernung des Stratum corneum oder die Behandlung mit depilating Reagenz direkt angewendet. Die Entfernung des Epithels verhornten erleichtert DNA die epidermalen Barriere und Interaktion mit Keratinozyten und Langerhans'schen Zellen kreuzen 5 – Immunantworten zu induzieren. Während eine große Oberfläche für die DNA-Transfer zur Verfügung steht und dieser Ansatz ist nicht mit Nadeln, gibt es einschließlich Nachteile der Anforderungfür die großen Mengen an DNA (10-100 ug), harter Behandlung auf der Haut durch Strippen und die inkonsistenten Ergebnisse der Immunantwort in den immunisierten Tieren ohne DNA – Abgabe Booster 6 induziert wird . Mikroteilchen-vermittelte intrazelluläre Abgabe nackten DNA auf die Haut wurde zum Induzieren von Immunantwort , 7, 8 sehr leistungsfähig und reproduzierbar erwiesen. Tragbares Genkanone verwendet worden ist, die Haut Zielstelle mit Plasmid – DNA-beschichteten Goldteilchen 2 & mgr; m-Durchmesser in der Größe mit Hilfe von Druckluft Heliumstrom 9 zu bombardieren. Der Plasmid – DNA wird vermutlich durch KCsand dendritische Zellen (DCs) in der Haut und das Protein aufgenommen wird lokal ausgedrückt , oder 10 bis ableitenden Lymphknoten von DCs transportiert wird. Obwohl die Gen – Kanone System ist einfach und erfordert begrenzte technische Erfahrung, die Kosten für die Herstellung und Lieferung des "DNA – bullassen "(dh Goldpulver, Heliumgas) und für die Gen – Kanone selbst seine allgemeine Geltung hat beschränkt. Darüber hinaus die Leichtigkeit des Genkanone Transports die Forderung nach einem Heliumgas – Abgabesystem begrenzt , wenn die Experimente an verschiedenen Orten durchgeführt werden. Microseeding ist 11 eine höhere Effizienz des Gentransfers als Einzelinjektion und Teilchenbeschuss gezeigt zu erreichen. Microseeding eine Tätowierung Pistole verwendet , ohne die Verwendung von Partikeln Wülste 11. Oszillieren der Mikronadel auf der Haut ist mit diesem Ansatz DNA auf die Haut zu liefern wahrscheinlich direkt die Zellmembran schaben und so DNA zu mehreren Zellen gleichzeitig übertragen. jedoch mit der großen Anzahl von Injektionen verbundenen Schmerzen mit 0,254 mm Durchmesser Nadeln ein Nachteil ist.

Hier bieten wir einen alternativen Ansatz zur DNA – Verabreichung in vivo. Die „acufection“ </strOng> Protokoll wir hier beschrieben wird, liefert eine wirtschaftliche und effiziente Weise Plasmid-DNA in Mäusehaut zu liefern. Kurz gesagt, wurden zehn Akupunkturnadel (0,2 mm Durchmesser x 13 mm Länge) in einem Bündel durch ein Klebeband gebunden. Ein Volumen von 10 & mgr; l PBS mit 10 ug Plasmid-DNA, die das Transgen von Interesse enthält, wurde auf der rasierten, Enthaarungscreme behandelter Flanke Haut platziert. Durch die Verwendung von Bündel der Akupunkturnadel, die Oberfläche (1 cm x 1 cm) der Haut, die Keratine an der Hornschicht zu oszillieren wurden gelöst und die Plasmid-DNA auf die Oberfläche aufgebracht wurde, in die Epidermis absorbiert. Hautschäden wurden überwacht und minimal sein gefunden. Die Expression des transfizierten Gens in der acufected Haut wurde sowohl durch quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA bestätigt. Die immunmodulatorische Wirkung von acufection-lieferte IL-15ΔE7 auf kutane Entzündung wurden unter Verwendung des IMQ behandelter demonstriert Mausmodell 12. Während acufection beweist eine einfache und weniger dema seinnden Verfahren zur DNA – Verabreichung in vivo, hat sie die optimale Menge an DNA für verschiedene Gene und die Zeiten , um die Haut stechen sorgfältig optimiert werden , um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Protocol

Weibliche Mäuse in 8 bis 12 Wochen alt wurden für diese Studie verwendet. C57 / BL6 – Wildtyp (WT) und IL-15 defiziente (IL – 15 – / -) Mäuse wurden von National Laboratory Animal Center (NLAC) erworben, Taiwan und Taconic Farm, respectively. IL-15-defiziente (IL – 15 – / -) und IL-15-dominant (IL – 15 IL – 15 und +/- + / +) zeigten ein Verhältnis 1: 3 in der zweiten Generation aus der Kreuzung von IL – …

Representative Results

Während einige Rötung innerhalb der ersten Stunde nach dem Einstechen mit Akupunkturnadeln evident war, die Haut am Tag 2 und kein nachteiliger Hautreaktionen 7 bis Tag gelöscht wurde nach Einstechen (2A) beobachtet. Nadeleinstich sehr niedriges Niveau von epidermalen Orthokeratose und minimaler dermalen Infiltration von H & E – Analyse im Vergleich zu unbehandelter Haut (2B) induziert. Die Dicke der Epidermis <strong cla…

Discussion

Der kritischste Schritt die Expression des acufected Plasmid-DNA, um sicherzustellen, ist gleichmäßig zu schwingen und die Hornschicht der Haut zu lösen. Während die Nadeln drückt sanft, ohne die Haut zu schneiden, sollte die Kraft stark genug sein, um die Oberfläche zu drücken. Zur Erleichterung der Aufnahme von DNA in 10 & mgr; l Lösung auf einer 1 cm x 1 cm Oberfläche, sollten die Nadeln oszillieren up-and-down für etwa 100-mal in 30 s. Man kann die Kraft bestimmen, die die Haut stechen muss und durch d…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Finanzhilfe aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048) unterstützt. Wir danken Drs. Betty Wu-Hsieh und Chien-Kuo Lee an der NTU, Leigh Zerboni an der Stanford University und Dr. Peter Hoffmann an der Universität von Hawaii für das Manuskript zu lesen, Yun Chien an der NTU für die technische Unterstützung und Dr. Wen-Chi Wei in Landwirtschaft Biotechnologie Research Center an der Academia Sinica für technische Beratung.

Materials

Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAGEN 12143 Purification of plasmid DNA from E. coli
Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy
ScanScopeXT Aperio N/A Whole-field image scanner
MetaMorphⓇ Research Imaging Molecular Devices N/A Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells

Riferimenti

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

Play Video

Citazione di questo articolo
Lin, Y., Lee, T., Ku, C. Development of an Economical DNA Delivery System by “Acufection” and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

View Video