Udvikling af en økonomisk DNA Delivery System med "Acufection" og dens Anvendelse på Skin Research
Summary
Denne protokol er en omkostningseffektivt alternativ til ekspression nøgent plasmid-DNA i musehud. Det overordnede mål med protokollen er at levere immunrelaterede gener i hudvæv at afgrænse den funktionelle rolle af et specifikt gen i kutan inflammation.
Abstract
Dysregulering af immunrespons i huden er forbundet med en række menneskelige hudlidelser. Direkte overførsel af immunrelaterede gener i hudvævet er et fascinerende tilgang til at undersøge immunmodulation af kutane inflammation i musemodeller for humane sygdomme. Her præsenterer vi en omkostningseffektiv protokol, leveret nøgent DNA i musehud og fører til transgen ekspression. Fremgangsmåden er opfundet "acufection", der betegner acu punktering-medieret DNA-trans fektion. At udføre acufection blev musehud først infunderes med DNA i phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter prikkes let med et bundt af akupunktur nåle for at lette absorptionen af DNA og transfektion ind i celler. Plasmid-DNA'et formentlig optages af keratinocyt og dendritiske celler (DC'er) i huden og udtrykt til protein. Mekanisk prick med nåle per se bevirkede ikke skader huden eller fremkalde keratinocyt aktivering. udtrykketaf de transficerede gener blev detekteret i huden på både transkriptionelle og translationelle niveauer efter acufection i 2 dage og opretholdt op til 7 dage. Det primære mål for udviklingen af denne acufection metode var at undersøge et hidtil udefineret isoform af IL-15. Anvendelse af denne fremgangsmåde, et alternativt splejset IL-15-isoformen med delvist fjernede exon 7 (IL-15ΔE7) blev udtrykt i huden og behandles efterfølgende med et Toll-lignende receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), at inducere inflammation. Acufection leveret IL-15ΔE7 i huden undertrykt keratinocytproliferation, epidermal tykkelse og neutrofilrekruttering i IMQ-induceret kutan inflammation. Med stigende interesse i at identificere de regulatoriske mekanismer for kutan inflammation, protokollen beskrevet her tilvejebringer en omkostningseffektiv og alsidigt alternativ til genkanonen system eller mikropodning til DNA levering in vivo. Det kan potentielt give opdagelse af funktionen af et hidtil ukendtgen i huden eller til undersøgelse ny behandling for hudsygdomme.
Introduction
Huden er den første linje af vært forsvar. Keratinocytter (KCS) er den vigtigste celletype i huden på mennesker og mus. Som respons på miljømæssige stimuli (f.eks sollys, ilt, kemikalier og patogene invasion), er KCS aktiveres og producere en bred vifte af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner, såsom IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α og GM-CSF 1. Sammen udløse rekruttering af immunceller til huden. Forværret kutan inflammation er ofte forbundet med en række humane sygdomme, herunder akut ektopisk kontaktdermatitis og kronisk T-cellemedieret inflammation (f.eks allergisk kontakteksem og psoriasis) 2. Modulering proinflammatoriske reaktioner i huden ved at hæmme KC aktivering er en plausibel tilgang til behandling af kutan inflammation. Denne protokol beskriver en ny tilgang til transient at udtrykke et cytokingen i epidermis for at studere immune response en følge af en sådan behandling i huden.
Epidermis komponerer den mest overfladiske lag af huden. Det tjener som en fysisk barriere holde eksterne stoffer såsom nukleinsyrer og patogener i at komme ind i de dybere lag af huden. Adskillige nålefri teknikker er blevet fastsat for epidermal DNA-transfer 3, 4. DNA i opløsning eller forbundet med kationiske liposomer eller adenovirusvektorer er direkte påført på epidermis modificeret med teknikker såsom fjernelse af stratum corneum eller behandling med depilating reagens. Fjernelse af forhornet epitel letter DNA krydser epidermal barriere og interaktion med keratinocytter og Langerhans-celler til at inducere immune 5 responser. Mens en stor overflade er til rådighed for DNA-overførsel og denne fremgangsmåde ikke involverer nåle, der er ulemper, herunder kravetfor de store mængder DNA (10 – 100 ug), barske behandling på huden ved stripning, og de inkonsistente resultater i inducere immunrespons i de immuniserede dyr uden DNA levering booster 6. Mikropartikel-medieret intracellulær levering af nøgent DNA til huden har vist sig at være yderst effektiv og reproducerbar til induktion immunrespons 7, 8. En håndholdt genkanon er blevet brugt til at bombardere huden målstedet med plasmid DNA-coatede guldpartikler 2 um diameter i størrelse ved hjælp af tryksat helium luftstrøm 9. Plasmid-DNA'et formentlig optages af KCsand dendritiske celler (DC'er) i huden og proteinet er lokalt udtrykt eller transporteres til drænende lymfeknuder af DC'er 10. Selvom det gen pistol systemet er enkel og kræver begrænset teknisk erfaring, prisen for at udarbejde og levere "DNA bullad "(dvs. guldpulvere, helium gas) og for genkanonen selv har begrænset sin generelle anvendelse. Derudover kravet om en helium gasleveringssystem begrænser nem genkanon transport, når man udfører eksperimenter ved forskellige steder. mikropodning har vist sig at opnå en højere effektivitet af genoverførsel end enkelt injektion og partikelbombardement 11. mikropodning bruger en tatovering pistol at afgive DNA til huden uden brug af partikel perler 11. Oscillerende mikronålene på huden ved hjælp af denne fremgangsmåde sandsynligvis direkte skrabe cellemembranen og dermed overføre DNA til flere celler samtidig. Men smerter forbundet med det store antal injektioner med nåle mm diameter 0,254 er en ulempe.
Her giver vi en alternativ tilgang til DNA levering in vivo. Den "acufection" </strong> protokol vi beskrevet her tilvejebringer en økonomisk og effektiv måde at levere plasmid-DNA i musehud. Kort fortalt blev ti akupunktur nåle (0,2 mm i diameter x 13 mm i længden) bundet i et bundt med klæbende tape. Et volumen på 10 pi PBS med 10 ug plasmid-DNA indeholdende transgenet af interesse blev placeret på den barberede, hårfjerningscremen-behandlede flanke hud. Ved anvendelse af akupunkturnål bundtet at oscillere overfladen (1 cm x 1 cm) af huden, blev keratiner på hornlaget løsnes og plasmid-DNA'et påføres overfladen blev absorberet ind i epidermis. Hud skader blev overvåget og fundet at være minimal. Ekspression af det transficerede gen i acufected hud blev bekræftet ved både kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) og ELISA. Immun modulatoriske virkninger af acufection leveret IL-15ΔE7 på kutan inflammation blev påvist under anvendelse af IMQ-behandlede musemodel 12. Mens acufection viser sig at være en nem og mindre demande fremgangsmåde til DNA-afgivelse in vivo, den optimale mængde af DNA til forskellige gener og de tidspunkter at punktere huden skal være omhyggeligt optimerede for at opnå reproducerbare resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiske trin for at sikre ekspressionen af acufected plasmid-DNA er til jævnt oscillere og løsne hornlag af huden. Samtidig med at skubbe nåle forsigtigt uden at skære huden skal kraften være hårdt nok til at nedtrykke overfladen. For at lette absorption af DNA i 10 pi opløsning på en 1 cm x 1 cm overfladeareal, bør nåle oscillere op-og-ned til omkring 100 gange på 30 s. Kan man bestemme den kraft, der skal punktere huden og ved at notere det antal gange, der er nødvendige til opnåelse af be…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af bevilling fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MEST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Vi takker Drs. Betty Wu-Hsieh og Chien-Kuo Lee på NTU, Leigh Zerboni på Stanford University og Dr. Peter Hoffmann ved University of Hawaii for at læse manuskriptet, Yun Chien på NTU for teknisk assistance, og Dr. Wen-Chi Wei på landbrug bioteknologi Research center ved Academia Sinica for teknisk rådgivning.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
Riferimenti
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
