तैयारी और मोटी जैविक नमूने का अवलोकन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी ट्रांसमिशन द्वारा
Summary
This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.
Abstract
This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.
Introduction
1970 के दशक के बाद से, टोमोग्राफी संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) व्यापक रूप से जैविक नमूनों 1, 2, 3 की संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है में दृष्टिकोण। संचरण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी की अपील है कि यह कोशिकाओं की वास्तुकला और macromolecular परिसर और प्रोटीन की संरचना करने के लिए अंगों की फैटी से nanometer पैमाने पर जैविक संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था। फिर भी, संचरण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी बहुत मोटी नमूने (अधिक से अधिक 0.5 माइक्रोन) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। दरअसल, मोटी नमूनों भी कई बिखर इलेक्ट्रॉनों का उत्पादन, कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) छवियों पैदा होता है। इसके अलावा, टोमोग्राफी नमूना झुकाव कोण के साथ बढ़ के स्पष्ट मोटाई के साथ, झुका नमूनों की छवियों का संग्रह शामिल है। हालांकि स्थिर बिखरने फ़िल्टर किया जा सकताऊर्जा फिल्टर का उपयोग कर बाहर, उच्च SNR छवियों के लिए आवश्यक इलेक्ट्रॉनों की आलोचना की राशि मात्र मंदिर में पहुँच जाता है। इसलिए, मोटी जैविक नमूनों केवल सेक्शनिंग 4 का उपयोग कर अध्ययन किया गया है।
कुछ नमूने कटा हुआ नहीं किया जा सकता: कुछ जब वे काट रहे हैं नीचा हो सकता है, और दूसरों के क्रम में उनकी जटिलता को समझने के लिए अपनी संपूर्णता में अध्ययन किया जा करने की जरूरत है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण स्कैनिंग मोड 5, 6, 7, 8 में मंदिर का प्रयोग है। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) स्कैनिंग में, इलेक्ट्रॉनों की ऑप्टिकल पथ कि पारंपरिक मंदिर में से अलग है। इलेक्ट्रॉनों बिखरने के बिना नमूना के माध्यम से गुजर रहा है, एक उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) डिटेक्टर 9 के साथ ऑप्टिकल अक्ष पर एकत्र किया जा सकता लचीलेपन से बिखरे हुए उन एक काले क्षेत्र (डीएफ) डिटेक्टर के साथ ऑप्टिकल धुरी से एक खास कोण पर एकत्र किया जा सकता है, जबकि।स्टेम के अन्य लाभ यह है कि ध्यान केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम नमूना की सतह पर जांच होती है, छवियों के पिक्सेल द्वारा पिक्सेल संग्रह सक्षम करने के लिए है। हालांकि इलेक्ट्रॉन बीम, जबकि नमूना 10 के माध्यम से गुजर broadens, इस विशेष संग्रह योजना के कम पारंपरिक मंदिर से inelastically बिखर इलेक्ट्रॉनों के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, वहाँ स्टेम में कोई लेंस के बाद नमूना है, जिससे रंगीन aberrations कि मंदिर में हो सकता है परहेज है। कैमरा लंबाई समायोजित किया जा सकता है ताकि बीएफ डिटेक्टर मुख्य रूप से unscattered इलेक्ट्रॉनों का पता लगाता है। मोटी नमूने का अध्ययन करने के DF डिटेक्टर का उपयोग कर एकाधिक बिखरने, जो गलत छवियों का उत्पादन की वजह से सिफारिश नहीं है। इसके बजाय, बीएफ डिटेक्टर 11 का इस्तेमाल किया जा सकता है। स्टेम उच्च SNR छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, यह अपेक्षाकृत उच्च बीम अभिसरण मंदिर की तुलना की वजह से एक अपेक्षाकृत कम गहराई का क्षेत्र है, में गहराई से जानकारी की मात्रा है कि मोटी से बरामद किया जा सकता को कमनमूनों। विपथन को सही स्टेम सूक्ष्मदर्शी, जहां अभिसरण कोण 30 mrad के रूप में उच्च हो सकता है के मामले में, गहराई का क्षेत्र काफी कम हो सकता है इतना है कि जानकारी के ध्यान में है कि केवल कुछ नैनोमीटर के एक फोकल हवाई जहाज़ से निकलती है । समानांतर मोड में इलेक्ट्रॉन बीम की स्थापना गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन बीम का संकल्प 12 की हानि के लिए बढ़ाता है। हालांकि, इस सेटअप हमेशा संभव नहीं है।
जब भी यह एक अभिसरण इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, एक तकनीक है कि गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन बीम के बढ़ाने जब मोटी नमूने का अध्ययन कर उपयोग करना चाहिए। हाल के अध्ययनों में फोकस जानकारी 13, 14 की अधिकतम राशि की वसूली के लिए नमूना भर में विभिन्न फोकल विमानों में एकाधिक छवियों के अधिग्रहण की सूचना है। दो अध्ययनों विभिन्न फोकल विमानों से जानकारी को संभालने के लिए अलग अलग तरीकों का वर्णन है। Hovden एट अल।फूरियर अंतरिक्ष में संयुक्त छवियों कि विभिन्न फोकल विमानों पर एकत्र किए गए थे, और अंतिम पुनर्निर्माण बदलना 13 3 डी उलटा फूरियर से सीधे प्राप्त हुई थी। इसके विपरीत, Dahmen एट अल। असली अंतरिक्ष में विभिन्न फोकल विमानों 14 से 3 डी की मात्रा को फिर से संगठित करने के लिए एक अभिसरण किरण पुनर्निर्माण इंजन विकसित किया है। हमारी प्रयोगशाला भी इमेजिंग मोटी जैविक नमूनों के लिए एक विधि विकसित की है। हमारी रणनीति है कि ऊपर वर्णित दो तरीकों से अलग हम जानकारी विभिन्न फोकल विमानों में ध्यान में है कि विलय कर दिया और एक समानांतर बीम प्रोजेक्टर 15 का उपयोग वास्तविक अंतरिक्ष में अंतिम 3 डी की मात्रा को खंगाला था। हमारा उद्देश्य एक तरीका है कि आसानी से किसी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगशाला में किया जा सकता है विकसित करने के लिए किया गया था। यह अंत करने के लिए, हम समय की एक सीमित मात्रा में है, पारंपरिक टोमोग्राफी प्रयोगों की समय सीमा के लिए तुलनीय में फोकल छवियों को इकट्ठा करने के उद्देश्य से। इसके अलावा, हमारे प्रस्तावित विधि गसंरेखण और पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के विभिन्न प्रकार के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा ould।
2015 में 15 से हमारे प्रकाशन के संदर्भ में, हम कल्पना और गहराई के क्षेत्र की वसूली के लिए चिह्नित करना चाहता था, इसलिए हम 25 mrad की एक बड़ी अभिसरण अर्द्ध कोण इस्तेमाल किया। यहाँ, हम विधि 2015 15 में हमारी प्रयोगशाला में विकसित के अनुसार स्टेम के माध्यम से फोकल इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल मौजूद है, और हम वर्तमान कैसे 2015 से डेटा संसाधित किया गया था। इस विधि को एक मोटी (750 एनएम) जैविक नमूने भर में कई फोकल विमानों से फोकस जानकारी ठीक नहीं है और उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी पुनर्निर्माण सक्षम बनाता है। जहां प्रासंगिक, इस पद्धति अन्य समूहों द्वारा इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में मतभेद भी प्रस्तुत कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में, हम के माध्यम से फोकल टोमोग्राफी स्टेम का उपयोग कर मोटी जैविक नमूने पर 3 डी विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड के साथ एक पारंपरिक नमूना तैयार प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जैविक नम?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
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