Préparation et observation d'échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

Depuis le début des années 1970, la tomographie par des approches en microscopie électronique à transmission (MET) ont été largement utilisés pour la caractérisation structurale des échantillons biologiques ^{1, 2, 3.} L'appel de la tomographie d'émission d'électrons est qu'il pourrait être utilisé pour étudier un grand nombre de structures biologiques à l'échelle du nanomètre, de l'architecture des cellules et organites l'ultrastructure de la structure des complexes macromoléculaires et des protéines. Néanmoins, la tomographie d'émission d'électrons ne peut pas être utilisé pour étudier des échantillons très épais (supérieur à 0,5 um). En effet, les spécimens épais produisent trop d'électrons dispersés, générant faible rapport signal sur bruit (SNR) images. En outre, la tomographie implique la collecte d'images de spécimens basculées, l'épaisseur apparente de l'échantillon augmente avec l'angle d'inclinaison. Même si la diffusion inélastique peut être filtréeà l'aide de filtres d'énergie, la quantité critique d'électrons nécessaires pour les images SNR élevé est atteint à peine en TEM. Par conséquent, les échantillons biologiques épais ont seulement été étudiés en utilisant sectionnant ^4.

Certains échantillons ne peuvent pas être tranchés: certains pourraient se dégrader quand ils sont coupés, et d'autres doivent être étudiées dans leur intégralité afin de comprendre leur complexité. Une autre approche consiste à utiliser TEM en mode ^{5, 6, 7, 8} numérisation. En microscopie électronique à balayage en transmission (STEM), le trajet optique des électrons est différente de celle TEM classique. Electrons passant à travers l'échantillon sans diffusion peuvent être collectées sur l'axe optique avec un champ lumineux (BF) détecteur ^9, alors que ceux dispersés élastiquement peuvent être collectées à un certain angle par rapport à l'axe optique avec un détecteur de champ foncé (DF).L'autre avantage de STEM est que le faisceau d'électrons focalisé est balayé sur la surface de l'échantillon, ce qui permet la collecte de pixel par pixel des images. Même si le faisceau d'électrons élargit en passant à travers l'échantillon ^10, ce système de collecte particulier est moins sensible aux électrons inélastique que TEM conventionnel. En outre, il n'y a pas d'objectif post-spécimen STEM, évitant ainsi les aberrations chromatiques qui peuvent survenir dans TEM. La longueur de la caméra peut être réglée de telle sorte que le détecteur de BF détecte principalement les électrons non dispersés. En utilisant le détecteur DF pour étudier des échantillons épais est pas recommandé en raison de la diffusion multiple, qui produit des images inexactes. Au lieu de cela, le détecteur de BF peut être utilisé ^11. Alors que STEM peut produire des images SNR élevés, il a une relativement faible profondeur de champ en raison de la convergence de faisceaux relativement élevé par rapport à TEM, ce qui diminue la quantité d'informations en profondeur qui peut être récupéré à partir d'épaisseurspécimens. Dans le cas des microscopes SOUCHES aberration corrigée, où l'angle de convergence peut être aussi élevé que 30 mrad, la profondeur de champ-peut être suffisamment faible pour que l'information qui est mise au point provient d'un plan focal de seulement quelques nanomètres . La mise en place du faisceau d'électrons en mode parallèle augmente la profondeur de champ du faisceau d'électrons , au détriment de la résolution ^12. Cependant, cette configuration est pas toujours possible.

Chaque fois qu'il est nécessaire d'utiliser un faisceau d'électrons convergent, on doit employer des techniques qui améliorent la profondeur de champ du faisceau d'électrons lorsque l'on étudie des échantillons épais. Des études récentes ont rapporté l'acquisition de plusieurs images à différents plans focaux à travers l'échantillon pour récupérer le maximum d'informations de mise au point ^{13, 14.} Les deux études décrivent différentes façons de traiter les informations provenant des différents plans focaux. Hovden et al.combinés dans l' espace de Fourier les images qui ont été recueillies à divers plans focaux, et la reconstruction finale a été obtenue directement à partir de l'inverse 3D transformée de Fourier ^13. En revanche, Dahmen et al. développé un moteur de reconstruction du faisceau convergent pour reconstruire dans l' espace réel le volume 3D à partir des différents plans focaux ^14. Notre laboratoire a également développé une méthode pour l'imagerie des échantillons biologiques épais. Notre stratégie était différente des deux méthodes décrites ci – dessus en ce que nous avons fusionné l'information qui est mise au point dans les différents plans focaux et reconstruit le volume 3D finale dans l' espace réel à l' aide d' un projecteur de faisceau parallèle ^15. Notre objectif était de développer une méthode qui peut facilement être effectuée dans un laboratoire de microscopie électronique. À cette fin, nous avons cherché à recueillir des images de liaison en une quantité limitée de temps comparable à la période des expériences de tomographie conventionnelle. En outre, notre méthode proposée could être adapté pour être utilisé avec différents types d'alignement et d'un logiciel de reconstruction.

Dans le cadre de notre publication à partir de 2015 ^15, nous voulions visualiser et caractériser la récupération de la profondeur de champ, nous avons donc utilisé un demi-angle de 25 mrad grande convergence. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour effectuer par focale imagerie STEM selon la méthode développée dans notre laboratoire en 2015 ^15, et nous présentons comment les données de 2015 ont été traitées. Cette méthode récupère les informations de mise au point de plusieurs plans focaux à travers un (750 nm) échantillon biologique épais et permet des reconstructions 3D de haute qualité. Le cas échéant, les différences dans cette méthode par rapport aux méthodes utilisées par d'autres groupes sont également présentés.

Protocol

Attention: Consultez les fiches de données de sécurité (FDS) des différents réactifs avant de les utiliser. Plusieurs des produits chimiques utilisés lors de la préparation de l'échantillon sont toxiques, cancérigènes, mutagènes et / ou reprotoxiques. Utiliser un équipement de protection individuelle (gants, blouse, pantalon pleine longueur et des chaussures fermées) et de travailler sous une hotte lors de la manipulation de l'échantillon. Sectionnement l'échantillon avec un ultramicrotome imp…

Representative Results

Dans notre étude, les électrons sont accélérés à 200 kV dans le microscope électronique à transmission du pistolet à émission de champ. Les images ont été recueillies en mode STEM de BF en utilisant un temps de séjour de 20 ms. En ce qui concerne la conception de l'inclinaison de la série par le biais-focal, nous avons constaté que les intervalles de mise au point de 150 nm ont donné des résultats satisfaisants pour l'étude ultrastructurale d'un échantillon…

Discussion

Dans cet article, nous présentons un protocole de préparation d'échantillon classique avec un guide étape par étape pour effectuer une analyse en 3D sur des échantillons biologiques épais en utilisant STEM par focale de positons. Enrobage de résine de spécimens biologiques a été utilisé pendant des décennies ^26, et d' autres protocoles qui sont adaptés aux différents types d'échantillons peuvent être trouvés dans la littérature ^27. En revanch…

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS