İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Nüfusu tek tek hücrelerin tek tip bir fizyolojik uyarıcı, 1, 2, 3, 4 çok farklı tepkiler gösterebilirler. Bir popülasyonda hücrelerin genetik varyasyonu bu tepkilerin çeşitli mekanizmalardan biri olmakla birlikte, daha hücre klonal popülasyonunda, yanıtların çeşitliliğini artırmak olmayan çeşitli genetik faktörler de vardır. Örneğin, tek tek proteinlerin ve diğer önemli sinyal molekülleri seviyeleri, aşağı doğru gen sentezleme profillerinin değişimine yol açan, bir hücre tarafından hücre bazında değişebilir. Buna ek olarak, gen aktivasyon kaymasının 7, 8, 9 her transkript, nispeten az sayıda sınırlı olabilir transkript 5, 6 kısa süreli patlamaları oluşabilir. böyleGen aktivasyon stochasticity büyük ölçüde biyolojik yanıt değişikliklere katkıda ve fizyolojik bir uyarıcıya yanıt mikroorganizmalar 10 ve memeli hücrelerinde 1 2 seçici bir avantaj sağlayabilir. Nedeniyle değişkenlik hem genetik hem de genetik olmayan kaynaklara, bir uyarıcıya tepki olarak belirli bir hücre gen tanımlama profili dökme yanıtın ölçülmesi elde edilen ortalama gen tanımlama profili büyük ölçüde farklılık gösterebilir. tek tek hücreler bir uyarıcıya tepki olarak değişkenlik göstermektedir ne ölçüde belirlenmesi tek tek hücrelerin izole edilmesi için teknikler gerektirir, ilgi konusu transkript için ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi, ve elde edilen sentezleme verilerinin sayısal analizi.
maliyetleri geniş bir kaplama, tek bir hücre içinde gen ekspresyonunu analiz etmek için çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır transkriptlerin sayısı problanmış veölçümü doğruluğu. Örneğin, tek hücreli RNA Seq transkript içerisinde ve tek tek hücreler en yüksek ölçüde sentezlenen genler için farklı transkript binlerce ölçmek için yeteneği geniş bir derinliğe sahiptir; maliyetler düşmeye devam rağmen, ancak böyle bir sıralama derinliği ile ilişkili maliyet, engelleyici olabilir. Bunun aksine, in situ hibridizasyon (smRNA FISH), tek bir molekül, RNA floresan için transkriptlerin kesin miktarının sunar daha düşük ifade ilgili gen başına makul bir maliyetle genleri; Bununla birlikte, hedef genlerin sadece az sayıda bu yaklaşım, belirli bir hücre içinde analiz edilebilir. Bu protokol açıklanan kantitatif PCR bazlı deneyler, bu teknikler arasında bir orta yol sağlar. Bu deneyler kadar 96 hücrelerinde aynı anda ilgi 96 transkript kadar ölçmek için mikroakışkan gerçek-zamanlı PCR makinesi kullanmaktadır. Yukarıda bahsedilen yöntemlerin her biri, gerekli donanım maliyetlerini olsa da, herhangi bir tek tek qPCR tahlilinde maliyeti nispetendüşük. Bu protokol, mikroakışkan gerçek-zamanlı PCR makinesi üreticisi (Protokol ADP 41, Fluidigm) önerdiği bir uyarlanmıştır. PCR-temelli yaklaşımla her transkript mutlak sayısının tahmini etkinleştirmek için, birden fazla deneyler arasında kullanılabilir Hazırlanan hedef gen amplikonlarının iç kontrollerin faydalanmak için protokol genişlettik.
Bu tekniğin bir örneği olarak, MCF-7 insan göğüs karsinoma hücrelerinde tümör baskılayıcı p53'ün düzenlenen genlerin ifadesinin ölçümü 11 tarif edilmiştir. Hücreler DNA çift iplikli tatili uyaran bir kimyasal madde ile zorlanmaktadır. Daha önceki çalışmalar, DNA çift iplikli kırılmalara p53 yanıt hem de p53 seviyeleri 12 açısından ve farklı hedef genlerin 11 aktivasyonu tek tek hücrelerin heterojenlik büyük bir sergilediğini göstermiştir. Ayrıca, p53 100 ekspresyonunu düzenleyenHücre döngüsü tutuklama, apoptozi ve yaşlanma 13, 14 dahil olmak üzere birçok aşağı akış yolakları, yer alan hedef genlerin iyi karakterize edilir. Her bir hücrede p53 aracılı tepki kompleksi hem değişken hem de olduğu bir yaklaşım sistem faydaları analizi teknikleri, yaklaşık 100 hedef genler, aşağıda anlatıldığı gibi, tek tek hücrelerin, eş zamanlı olarak incelenebilir. (Örneğin, tek hücreli izolasyonu ve liziz alternatif yöntemler olarak) hafif değişiklikler, protokol kolaylıkla memeli hücre tipleri, transkriptlerin ve hücresel tepkilerin bir geniş bir çalışma için adapte edilebilir.
Uygun önceden hazırlık, hücre sıralama ve gen ifadesi ölçüm yuvarlak üç günlük bir süre boyunca bu protokole göre yapılabilir. Aşağıdaki zamanlama önerilmektedir: önceden, ilgi transkript seçin belirlemek ve bu TRANSCR cDNA yükseltmek primer çiftleri doğrulamakIPTS ve standartları ve bu primerler kullanılarak primer karışımları hazırlayın. Gün 1, hücre tedavisi, hasat takip ve hücreleri sıralamak, ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon gerçekleştirmek ve adi primerler kaldırmak için bir eksonükleaz ile örnekleri davranın. 2. Gün, qPCR kullanılarak sıralanır hücreleri üzerinde kalite kontrolünü yapmak. Son olarak, 3. gün, mikroakışkan qPCR kullanılarak sıralanır hücrelerinde gen ifadesini ölçün. Şekil 1 ilgili adımları özetlemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu kültür içinde yetiştirilen yapışan hücreler popülasyonundan tek tek memeli hücrelerini izole etmek için, her hücrede yaklaşık 96 gen ekspresyonunu analiz etmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem iyi çalışması için iyi bir ön hazırlık çok önemlidir. primerler tek hücreli ölçümlerin kalitesini belirlemek olarak, özellikle ilgi transkriptleri (1.2-1.3 adımlar) özgü tasarımı ve test primer çiftleri, zaman alıcı ama önemli adımlardır. güvenilir bir primer çiftleri elde edil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında hücre sıralama yapmadan onu yardım için CCR ETIB Sitometrisi Core V. Kapoor teşekkür etmek istiyorum. Biz de bu protokolün geliştirilmesi sırasında qPCR performans onların yardım M. Raffeld ve CCR LP Moleküler Tanı Ünitesi ve J. Zhu ve NHLBI DNA Dizilimi ve Genomik Çekirdek teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Riferimenti
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetica. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
