여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 – 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.
인간의 탯줄 (UC) 및 태반은 어떤 윤리적이나 도덕적 문제를 제기하지 않기 때문에 점점 더 관심을 얻고있다 중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 비 침습적 원시적이고 풍부한 소스입니다. UC에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하기위한 현재의 방법은 가변 확산 전위와 소량의 세포를 얻었다. UC가 복잡한 해부학 기관이므로 MSC 특성의 차이는 분리 영역의 해부학 적 차이에 기인 할 수있다. UC, 코드 – 태반 접합부 (CPJ), 태반 및 태아 (FP) : 본 연구에서는 처음 세 이산 해부 영역에 코드 / 태반 샘플 해부. 둘째로, 두 개의 구별되는 영역이, 코드 라이닝 (CL)과 왓슨의 젤리 (WJ)를 분리 하였다. 체외 이식편 배양 기술은 다음 네 개의 소스로부터 세포를 분리하는 데 사용되었다. 체외 이식편의 세포의 일차 배양에 필요한 시간은 조직의 소스에 따라 변할. (4) 다 – 세포의 증생 (3) 내에서 발생한각각 CL / WJ 및 FP 이식편로부터 14 일 – 십일 11 – 7 성장 후에 관찰 된 반면 CPJ 외식 YS. 분리 된 세포를 플라스틱에 대한 접착 성이었고 마찬가지로 골수 유래 중간 엽 줄기 세포로, 예컨대 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105과 같은 fibroblastoid 형태 및 표면 마커를 표시. 그러나 CPJ-엽 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포와 WJ-변화 세포의 콜로니 형성 효율은 BM-MSC들보다 더 높은 효율을 나타내는. 네 개의 소스에서 중간 엽 줄기 세포들은 다 능성했다 나타내는, 지방 세포, 연골 및 골 형성 계보로 분화. CPJ-중간 엽 줄기 세포는 다른 MSC 소스에 비해보다 효율적으로 차별화. 이러한 결과는 CPJ 가장 유력한 해부학 영역이고, 시험 관내에서 더욱 증식 및자가 재생 능력을 가진 세포의 수를 높게 수율 제안. 결론적으로, 네 개의 소스로부터 중간 엽 줄기 세포의 비교 분석 CPJ 세포 요법 용 중간 엽 줄기 세포 regenerativ보다 유망한 소스 인 것으로 나타났다전자 의학 및 조직 공학.
줄기 세포는 여러 기관과 신체 조직에 존재한다. 그들은 재생 잠재력을 보유하고 인간의 삶 1, 2의 범위에 걸쳐 몸에 손상된 조직을 복구에 중요한 역할을한다. 이것은 특히 이후 성체 줄기 세포 (ASC를) 관심의 큰 거래를 생성 한 배아 줄기 세포 (는 ESC) 달리의 ASC의 사용은 도덕적, 윤리적 딜레마를 제기하지 않습니다. 몇몇 연구는 중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포) 등의 ASC의 고립을보고, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포); 및 지방 조직 (AT) 및 치과 펄프 3, 4, 5, 골수 (BM)에 이르기까지 다양한 성인 출처 등 다양한 조상. 그러나, 성인 틈새 시장의 대부분은 제한되고있어 존재의 ASC의 수는 자신의 분리는 일반적으로 가능한 기증자와 침략 고통스러운 과정을 포함한다사이트 이환율. 또한, 기증자의 나이와 환경 스트레스 또한 절연 세포 6, 7, 8의 품질과 생물학적 활성을 결정하는데 중요한 역할을 할 수있다. 의 ASC는 체외 배양시 증식 및 제한된 분화 잠재력을 표시.
현재의 ASC의 이러한 단점을 극복하기 위해 새로운 소스는 줄기 세포를 분리하기 위해 추진되고있다. 이러한 노력은 제대혈, 코드 조직, 태반, 유체 9 양수를 포함한 주 산기 소스로부터 줄기 세포의 분리로 이어졌다. 이 소스 때문에 쉽고 풍부한 가용성 10, 11, 12, 13의 관심을 얻고있다. 이들로부터 유도 된 또 산기 조직을 비 침습적으로 얻어진 줄기 세포 수는성인 소스 (14), (15)에서 분리의 ASC보다 더 원시적. 그들은 출생시 얻은 조직에서 분리되어 인해 노화 및 환경 스트레스 (16)에 게놈에 최소한의 변경을받은 것으로 간주됩니다.
그러나보고 된 주 산기 소스에서 줄기 세포의 특성과 그들의 잠재적 인 자기 갱신뿐만 아니라 차별화하는 17 널리 11 다릅니다. 이는 인간의 탯줄 (UC)는 복잡한 기관이다는 사실에 부분적으로있을 수 있습니다. 우리는 주 산기 조직의 분리 된 영역이 변화 및 비 산기 소스에서 파생 된의 ASC에 비해 이러한 줄기 세포의 원시적 특성에 대한 책임을 특정 틈새 시장을 만드는 것이 가설을 세웠다. UC, 코드 – 태반 접합부 (CPJ) 본 연구는 세 영역으로 이산 해부학 코드 / 태반 샘플의 박리를 설명태반 태아 D (FP). UC 추가로 두 개의 영역으로 해부했다 : 코드 라이닝 (CL)과 와튼의 젤리 (WJ). CL, WJ, CPJ 및 FP에서 분리 된 세포의 분석은 모든 fibroblastoid 형태를 전시하고 MSC 마커를 표현 시연,하지만 그들은 자신의자가 재생과 분화 가능성 달랐다. 이들 세포 치료, 재생 의학 및 조직 공학을위한 유망한 소스 만들기, UC-및 FP-유래 세포에 비해 CPJ-유래 세포는 증식과 자기 갱신 가능성의 높은 비율을 보였다.
줄기 세포 연구의 최근 발전은 기본 개발 프로세스에 대한 이해를 향상뿐만 아니라 생명 공학, 제약, 세포 치료, 재생 의학 및 조직 공학 응용 프로그램을 18, 19, 20에서 줄기 세포의 사용을 위해 유망한 기회를 제공뿐만 아닙니다. 초기 배아에서 분리 한 만능는 ESC가 가장 유망한 있지만, 그들은 기술적 인 문제와 윤리적 딜레마 21, 22, 23에 직면 해있다. 성인 세포에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 대안을 제공하지만, 그들도 비슷한 기술 및 안전 문제 (23)에 직면 해있다. 또한, iPSCs 유 전적으로 안정되지 않거나, 따라서 그들의 치료 용도를 제한 후의 유전 적 변화를 가질 수있다. 줄기 세포는 출생 후 TIS의 다양한보고되었다고소 및 기관. 이들의 ASC의 가장 일반적인 소스는 골수, 지방 및 근육 조직이다. 그러나 출생 후 소스로부터의 ASC 성장과 분화 가능성 24, 25 제한됩니다. 또한 인한 노화 및 환경 스트레스에 노출 고통 때문에 항상 치료 응용 프로그램을 26, 27, 28에 대한 효능이 없습니다. 이것은의 ASC보다 더 순진 줄기 세포의 새로운 소스를 검색 할 우리와 다른 사람들을 주도하고있다.
우리의 ASC의 대안으로 원시 줄기 세포에 대한 주 산기 소스를 조사 하였다. 이 보고서에서 우리는 코드 / 태반 샘플에서 인간 중간 엽 줄기 세포를 분리 할 수있는, 신뢰할 수있는 강력하고 간단한 방법을 제공합니다. 의 ASC의 분리에 사용되는 다른 소스와 방법에 비해,이 방법은 HIG를 대량으로 분리하는 효율적이고 비 침습적 방법을 제공한다H-품질의 중간 엽 줄기 세포. 더 나아가 같은 BM 등 성인 소스에서 중간 엽 줄기 세포에 비해 주 산기 중간 엽 줄기 세포의 높은 성장과 분화 가능성을 강조한다.
태반 태아 부착 UC 두 동맥, 정맥, CL 포함한 독특한 해부학 적 영역으로 큰 장기이며, WJ (혈관 주위 조직). 여러 연구 변수 성장 전체 코드는 WJ, 또는 태반에서 중간 엽 줄기 세포의 분리를,보고 및 차별화, 29 (25)에서, 전위. 그럼에도 불구하고, 지금까지 어떤 연구는 효율적으로 조사하지 않고 코드 / 태반 샘플의 다른 해부학 적 영역에서 세포를 비교했다. 우리는 여기에 UC, CPJ의 해부에 대한 체계적이고 간단한 방법을 제공하고, 중간 엽 줄기 세포의 분리를 위해 FP를 연결. 우리는 또한 확산 capabil를 결정하여 특성과 분리 된 세포의 품질을 평가하는 종합적이고 간단한 프로토콜을 보여시달,뿐만 아니라자가 재생과 분화 잠재력. 이 방법은 재현성 및 우수한 품질의 중간 엽 줄기 세포를 대량 산출한다.
우리는 하나의 세포로 조직의 완전한 소화가 분리 된 세포의 가난한 수율을 가지고있는 반면 크기의 조직 조각 1-2mm의 부분 소화, 외식에서 상용 트립신 솔루션을 재현성있게 산출 세포를 사용하는 것을 발견했다. 그러나 한 연구는 UC의 큰 조직 절편은 대략 크기가 10mm 세포 분리 (30)에 대한 최적이라고보고했다. 반대로, 다른 연구는 조직 절편 방법은 효소 분해 방법 (31)에 비해 더 긴 문화주기 및 세포의 낮은 수율 결과 제안했다. 이전의보고에서, 코드의 처리 및 콜라게나 제 II 히알루로, 개별적으로 또는 트립신을 다음과 같이 조직 코드 셀들 (32, 33)를 분리하기 위해 수행 된 <sup> 34. 뿐만 아니라 이전의 배양에 코드 조직의 소화 방법의 변화의 큰 거래는이뿐만 아니라 분리 된 세포는 이종 것으로 나타났다. 더 긴 시간 기간 동안 열악한 효소의 사용은 세포 부착 및 증식에 영향을 미치는, 세포막을 저하시킬 수있다. 이 방법의 결과는 부분적으로 분해 된 조직 이식편 산기 광범위한 세포 손상을 유발하지 않고 세포의 생장을 제공하는 것으로 밝혀 생존을 유지하고, 중간 엽 줄기 세포의 동종 개체군의보다 많은 양을 얻었다.
외식에서 세포의 해부 및 절연을위한 프로토콜은 간단하지만, 일부 단계는 쉬운 일이 있습니다. 먼저, 배양 플라스크의 표면에 그 부착시킴으로써 이식편 부착을 보장한다. 이것은 단지 배양의 처음 2 시간 동안 조직 조각을 피복하고 신중 나머지 매체 추가 매체 소량을 사용하여 용이하게 할 수있다. 에스econd, T75 플라스크 당 15 개 이하로 이식편의 수를 제한한다. 조각 또는 플라스크 당 너무 많은 조각 사이의 공간이 너무 작은 세포 생장 억제 용이다. 배양 3 일 후에 배양 플라스크의 표면에 충실하지 않는 셋째, 조직 조각 준수 및 배양을위한 새로운 플라스크에 전송해야합니다. 넷째, 조직 조각 부착을 억제 세포 파편, 없어야 배양한다. 다섯째, 큰 조각의 배양 배지가 더 필요하고 세포 생장 효율이 향상되지 않는다. 세포가 빠르게 합류되고 티슈 소스에 따라 구분할 수 있으므로 마지막으로, 특히 세포 생장의 출현 후에, 가깝게 이식편 배양 물을 모니터. 기술의 몇 가지 제한은 CL, WJ, CPJ 및 FP를 분리하는 샘플을 해부에 대한 전문 지식의 부족을 포함한다; WJ 낮은 수율로 생성 된 작은 샘플 크기; 지연 – 처리 샘플을 수집하는 아보 2-4 시간 내에 처리 할 필요ID 세포 복구의 손실.
중간 엽 줄기 세포의 특성 분석을위한 황금 표준은 플라스틱을 고수 섬유 모세포 표현형을 형성하고, 여러 계통으로 분화 할 수있는 능력이다. 이들은 또한 ISCT 35 바와 같이 중간 엽 줄기 세포를 정의하기위한 일반적으로 사용되는 기준이다. 본 연구에서는 네 개의 소스에서 분리 된 세포는 플라스틱을 부착했다 및 MSC 마커 (CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105)하지만 조혈 마커 CD45에 대한 부정적인 표현을위한 긍정적 인 표현을했다. 또한, 그들은 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I을 발현하지만 HLA 클래스 II에 대한 음성이었다. BM-MSC들에 비해 WJ- CPJ 및 유래 세포는 높았다. 이러한 결과는 이전의보고와 일치하는 중간 엽 줄기 33, 36, 37, 38 UC 유래. 또한, 이러한 결과는 CL-가 WJ-가 CPJ-는 FP-엽 줄기 세포가 발현 pluri되었습니다이러한 OCT4, NANOG와 같은 효능 SOX2 유전자; 이전 39보고하지만, 그 표현은,는 ESC보다 낮았다. 이러한 결과는 주 산기 – 유래 세포 (40)의 만능 마커의 발현을보고 이전 연구와 일치도 있었다. 흥미롭게도,이 만능 마커의 발현이 다른 소스에서 분리 된 세포보다 CPJ-중간 엽 줄기 세포에서 더 높은 것을 관찰되었다. 또한 UC-중간 엽 줄기 세포는 BM-중간 엽 줄기 세포 (41)보다 더 큰 자기 갱신 잠재력을 전시 것을 발견했다. 흥미롭게도, 표현형 특성의 유사성에도 불구하고, 네 개의 소스에서 고립 된 세포는 변수 CFE 값을했다. 그러나, FP-MSC를 제외하고, 그들은 모두 BM-중간 엽 줄기 세포보다 더 CFE 값을했다. 다른 모든 중간 엽 줄기 세포에 비해 CPJ-중간 엽 줄기 세포는 증식의 가장 높은 CFE 값과 속도를 가지고 있었다. 또한 WJ- CPJ-및 중간 엽 줄기 세포는 BM-MSC들보다 분화 잠재력을 표시. CL-중간 엽 줄기 세포는 최소한의 차별화를 보여 주었다CPJ-중간 엽 줄기 세포 반면 세 계보 (즉, 지방 세포, 연골 및 골 형성)에 가능성이 가장 높은 trilineage 차별화 가능성이 있고 FP-중간 엽 줄기 세포는 적어도 지방 세포 분화 잠재력을 표시.
결론적으로, 우리의 결과는 고립 된 중간 엽 줄기 세포의 질과 양이 코드 / 태반 샘플의 4 개 소스 사이에 차이가 있음을 보여 주었다. CPJ-중간 엽 줄기 세포보다 증식 능력과 더 큰 자기 갱신 잠재력을했다. 그들은 또한 trilineage의 세포 유형으로 분화에서 강력한했다. 때문에 낮은 배가 시간에, CPJ-중간 엽 줄기 세포는 빠르게 수 1,000 배 확대 및 높은 처리량 약물이나 생체 재료 검사에 사용 할 수있다. 이 세포는 세포 치료와 재생 의학 응용 프로그램에 대한 더 유망한 원천이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 OU-WB ISCRM, 오클랜드 대학과 미시간 머리와 척추 연구소에 의해 지원되었다. N 비라볼루와 C 맥키 오클랜드 대학에서 학장 대학원 연구 상을 수상했다. 우리는 원고를 검토하는 S 박시 주셔서 감사합니다.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |