Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.
Le cordon ombilical humain (UC) et le placenta sont des sources non-invasives, primitives et abondantes de cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui ont de plus en plus retenu l'attention parce qu'ils ne posent pas de problèmes éthiques ou morales. Les méthodes actuelles pour isoler de l'UC MSCs produisent de faibles quantités de cellules avec des potentiels de prolifération variables. Depuis UC est un organe anatomique complexe, les différences dans les propriétés MSC peuvent être dues à des différences dans les régions anatomiques de leur isolement. Dans cette étude, nous avons d'abord disséqué le cordon / échantillons de placenta en trois régions anatomiques discrètes: UC, jonction cordon-placenta (CPJ), et le placenta du fœtus (FP). D'autre part, deux zones distinctes, garniture de cordon (CL) et de la gelée de Wharton (WJ), ont été séparées. La technique de culture explant a été ensuite utilisée pour isoler les cellules des quatre sources. Le temps nécessaire à la culture primaire des cellules des explants varie en fonction de la source du tissu. L'excroissance des cellules a eu lieu à l'intérieur de 3 – 4 days des explants CPJ, alors que la croissance a été observée après 7 – 10 jours et 11 – 14 jours à CL / WJ et FP explants, respectivement. Les cellules isolées sont adhérentes au plastique et affichés morphologie fibroblastoïdes et des marqueurs de surface tels que CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et, de manière similaire à la moelle osseuse (BM) dérivée de cellules souches mésenchymateuses. Cependant, l'efficacité de formation de colonies des cellules a varié, avec CPJ-MSCs et WJ-MSCs montrant une efficacité plus élevée que BM-MSC. MSCs de quatre sources différenciées en adipocytaire, chondrogénique et lignées ostéogéniques, indiquant qu'ils étaient multipotentes. CPJ-différencié plus efficace MSCs par rapport aux autres sources de MSC. Ces résultats suggèrent que le CPJ est la région anatomique la plus puissante et donne un plus grand nombre de cellules, avec une plus grande prolifération et les capacités d' auto-renouvellement in vitro. En conclusion, l'analyse comparative des quatre MSCs de sources a indiqué que le CPJ est une source plus prometteuse pour la thérapie de cellules souches mésenchymateuses cellulaire, régénérativemédecine e, et l'ingénierie tissulaire.
Les cellules souches sont présentes dans divers organes et tissus du corps. Ils possèdent un potentiel de régénération et jouent un rôle majeur dans la réparation des tissus endommagés dans le corps pendant toute la durée de la vie humaine 1, 2. Cela a suscité beaucoup d'intérêt dans les cellules souches adultes (CSA), en particulier puisque, contrairement aux cellules souches embryonnaires (CSE), l'utilisation de ASCs ne pose pas de dilemmes moraux et éthiques. Plusieurs études ont rapporté l'isolement de ASCs, telles que les cellules mésenchymateuses (CSM); des cellules souches hématopoïétiques (CSH); et progéniteurs différentes, y compris diverses sources adultes allant de la moelle osseuse (BM) de tissu adipeux (A) et de la pulpe dentaire 3, 4, 5. Cependant, le nombre de présents dans la plupart ASCs des niches adultes est limité, et leur isolement implique généralement une procédure invasive et douloureuse avec un donneur possiblemorbidité du site. De plus, l' âge des donneurs et le stress environnemental pourraient également jouer un rôle important dans la détermination de la qualité et l' activité biologique des cellules isolées 6, 7, 8. ASCs afficher également la prolifération limitée et le potentiel de différenciation au cours de la culture in vitro.
Pour remédier à ces inconvénients de ASCs actuelle, de nouvelles sources ont été menées pour isoler des cellules souches. Ces efforts ont conduit à l'isolement des cellules souches à partir de sources périnatales, y compris le sang de cordon, le tissu du cordon, le placenta et le liquide amniotique 9. Ces sources ont attiré l' attention en raison de leur disponibilité facile et abondant 10, 11, 12, 13. En outre, les tissus périnatale peuvent être obtenus des cellules non effractive et souches dérivées d'entre eux sontplus primitif que ASCs isolés à partir de sources adultes 14, 15. Ils sont isolés des tissus obtenus à la naissance et sont considérés comme ayant subi des modifications minimales dans le génome en raison de contraintes de vieillissement et de l' environnement 16.
Cependant, les caractéristiques indiquées des cellules souches provenant de sources périnatales et leur potentiel d'auto-renouvellement, ainsi que de faire la différence varient considérablement 11, 17. Cela pourrait être en partie dû au fait que le cordon ombilical humain (UC) est un organe complexe. Nous présumons que les régions discrètes de tissu périnatal créer des niches spécifiques responsables des variations et de la nature plus primitive de ces cellules souches par rapport à ASCs provenant de sources non durant la période périnatale. Cette étude décrit la dissection des échantillons cordon / placenta en trois régions anatomiques distinctes: UC, jonction de cordon placenta (CPJ), und placenta fœtal (FP). L'UC a également été disséqué en deux zones: doublure de cordon (CL) et de la gelée (WJ) de Wharton. L'analyse des cellules isolées de CL, WJ, CPJ et FP ont démontré que tous présentaient une morphologie fibroblastoïde et ont exprimé des marqueurs de MSC, mais ils diffèrent dans leur auto-renouvellement et le potentiel de différenciation. cellules dérivées du CPJ ont présenté un taux de prolifération et le potentiel d'auto-renouvellement plus élevé par rapport aux cellules et UC- FP dérivées, ce qui les rend une source plus prometteuse pour la thérapie cellulaire, la médecine régénérative, et l'ingénierie tissulaire.
Les progrès récents dans la recherche sur les cellules souches non seulement amélioré la compréhension des processus de développement de base , mais également des perspectives prometteuses pour l'utilisation de cellules souches en médecine biotechnologique, pharmaceutique, thérapie cellulaire, de régénération, et les applications d'ingénierie tissulaire 18, 19, 20. Alors que pluripotentes isolées à partir de CES embryons précoces sont les plus prometteurs, ils sont confrontés à des défis techniques et dilemmes éthiques 21, 22, 23. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) dérivées de cellules adultes offrent une alternative, mais ils sont confrontés à des problèmes similaires trop techniques et de sécurité 23. En outre, CSPi peut ne pas être génétiquement stables ou peuvent avoir subi des modifications génétiques, limitant ainsi leur utilisation thérapeutique. Les cellules souches ont également été signalés dans une variété de tis post-natalepoursuit en justice et les organes. Les sources les plus courantes de ces ASCs sont la moelle osseuse, adipeuse, et le tissu musculaire. Cependant, à partir de sources ASCs après la naissance ont un potentiel de croissance et de différenciation limitée 24, 25. Ils souffrent également en raison du vieillissement et de l' exposition à des contraintes environnementales et donc ne sont pas toujours efficaces pour les applications thérapeutiques 26, 27, 28. Cela nous a conduit et d'autres à la recherche de nouvelles sources de cellules souches qui sont plus naïfs que ASCs.
Nous avons étudié les sources périnatales pour les cellules souches primitives comme une alternative à ASCs. Dans ce rapport, nous proposons une méthode fiable, robuste et simple d'isoler à partir d'échantillons humains MSCs cordon / placenta. En comparaison à d'autres sources et les méthodes utilisées pour l'isolement des CSA, ce procédé fournit un procédé efficace et non invasive permettant d'isoler de grandes quantités de higH-qualité MSCs. Il accentue encore le potentiel de croissance et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses plus périnatale par rapport à des sources de cellules souches mésenchymateuses adultes tels que BM.
L'UC fixation du fœtus au placenta est un grand organe de régions anatomiques distinctes, dont deux artères, une veine, CL, et WJ (tissu entourant les vaisseaux sanguins). Plusieurs études ont rapporté l'isolement des cellules souches mésenchymateuses du cordon tout, le WJ, ou le placenta, avec une croissance variable et la différenciation les potentiels 25, 29. Néanmoins, à ce jour, aucune étude n'a étudié et comparé efficacement les cellules de différentes régions anatomiques de l'échantillon cordon / placenta. Nous fournissons ici une méthode simple et systématique pour la dissection de l'UC, le CPJ et connecté FP pour l'isolement des cellules souches mésenchymateuses. Nous montrons également un protocole complet et simple pour caractériser et évaluer la qualité des cellules isolées en déterminant leur prolifération capabilITIES, ainsi que leur potentiel d'auto-renouvellement et de différenciation. Cette méthode est reproductible et donne une grande quantité de cellules souches mésenchymateuses de qualité supérieure.
Nous avons constaté que la digestion partielle des morceaux de tissu 1-2 mm de taille à l'aide d'une solution de trypsine commerciale cellules des reproductible explants cédé, alors que la digestion complète du tissu en cellules individuelles avaient de faibles rendements de cellules isolées. Cependant, une étude a rapporté que des explants de tissu plus grandes de taille UC environ 10 mm étaient optimales pour l' isolement de cellules 30. A l' inverse, une autre étude a suggéré que la méthode des explants de tissu entraîné dans un cycle de culture plus longue et un rendement plus faible de cellules par rapport à la méthode de digestion de l' enzyme 31. Dans les rapports précédents, le traitement des tissus avec cordon collagénase II et hyaluronidase, séparément ou à la suite de la trypsine, ont été effectuées pour isoler les cellules de la moelle 32, 33 <sup>, 34. Non seulement est-il beaucoup de variation dans les méthodes de digestion du tissu du cordon avant la culture, mais aussi les cellules isolées semble être hétérogène. L'utilisation d'enzymes dures pour des périodes plus longues peuvent dégrader la membrane cellulaire, ce qui affecte l'adhérence des cellules et la prolifération. Les résultats de cette méthode montrent que des explants de tissu périnatales partiellement digéré par l'excroissance de cellules fournies sans causer des dommages des cellules, maintenues viabilité, et ont produit des quantités plus élevées de populations homogènes de cellules souches mésenchymateuses.
Alors que le protocole pour la dissection et l'isolement des cellules des explants est simple, quelques-unes des étapes peut se révéler difficile. Tout d'abord, d'assurer le respect explants en permettant leur fixation à la surface du flacon de culture. Cela peut être facilité en utilisant une petite quantité de milieu, ne couvrant que les morceaux de tissu pour les 2 premières heures de la culture, puis en ajoutant soigneusement le milieu restant. Second, limiter le nombre d'explants à moins de 15 par flacon T75. Trop peu d'espace entre les pièces ou trop de pièces par flacon sont inhibiteurs pour la croissance des cellules. Troisièmement, les morceaux de tissu qui ne collent pas à la surface du flacon de culture après 3 jours d'incubation doivent être transférés dans un nouveau flacon pour l'adhérence et la culture. Quatrièmement, les morceaux de tissu à cultiver doit être exempte de débris cellulaires, qui inhibe la fixation. En cinquième lieu, la mise en culture de grandes pièces nécessite plus moyen et ne pas améliorer l'efficacité de la croissance des cellules. Enfin, surveiller les cultures de près explants, en particulier après l'apparition de l'excroissance des cellules, comme les cellules peuvent rapidement devenir confluentes et de se différencier en fonction de la source de tissu. Quelques limites de la technique comprennent un manque d'expertise en disséquant les échantillons pour séparer le CL, WJ, CPJ et FP; une petite taille de l'échantillon, ce qui entraîne un faible rendement de WJ; et traitement de l'retardés échantillons doivent être traitées dans les 2-4 heures suivant le prélèvement à Avoid une perte dans la récupération des cellules.
La norme d'or pour la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses est la capacité d'adhérer au plastique, forment le phénotype fibroblastique et se différencier en plusieurs lignées. Ce sont également des critères couramment utilisés pour définir MSCs comme décrit par le ISCT 35. Dans cette étude, les cellules isolées à partir de quatre sources étaient adhérentes au plastique et il y avait une expression positive pour les marqueurs de MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et négative), mais l'expression de la CD45 marqueur hématopoïétique. En outre, ils ont exprimé la classe antigène leucocytaire humain (HLA) I, mais ont été négatifs pour HLA de classe II. Par rapport à la BM-MSCS, et les cellules WJ- CPJ dérivées étaient plus élevés. Ces résultats sont cohérents avec les rapports précédents de l' UC dérivés 33 MSCs, 36, 37, 38. De plus, nos résultats ont montré que Cl-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs exprimé pluri-les gènes de virilité tels que OCT4, NANOG, et SOX2; cependant, leur expression était inférieur à celui des CES, tel que rapporté précédemment 39. Ces résultats ont également été en accord avec une étude antérieure qui a rapporté l'expression de marqueurs de pluripotence dans les cellules périnatales dérivées 40. Fait intéressant, il a été observé que l'expression du marqueur pluripotent était plus élevée dans CPJ-MSCs que dans les cellules isolées à partir d'autres sources. Il a également été remarqué que l'UC-MSCs présentait un plus grand potentiel d' auto-renouvellement de BM-41 MSCs. Fait intéressant, malgré des caractéristiques similaires phénotypiques, les cellules isolées à partir des quatre sources avaient des valeurs variables de CFE. Cependant, à l'exception des FP-MSC, ils avaient tous de meilleures valeurs CFE que BM-MSCS. CPJ-MSCs avait la valeur la plus élevée CFE et le taux de prolifération par rapport à tous les autres MSCS. De plus, et le CPJ-WJ- affichent des potentiels de cellules souches mésenchymateuses différenciation plus élevés que BM-MSCS. CL-MSCs a montré la moindre différenciationpotentiel dans les trois lignées (c. -à- adipocytaire, chondrogénique et ostéogénique), alors que le CPJ-MSCs avait le plus grand potentiel de différenciation et FP-trois lignées MSCs affiche le moins de potentiel de différenciation adipocytaire.
En conclusion, nos résultats ont montré que la qualité et la quantité des cellules souches mésenchymateuses isolées diffèrent entre les quatre sources de l'échantillon cordon / placenta. CPJ-MSCs avait une plus grande capacité de prolifération et un plus grand potentiel d'auto-renouvellement. Ils étaient aussi puissants dans leur différenciation dans les types de cellules de trois lignées. En raison de leur faible temps de doublement, le CPJ pourrait être-MSCs connu une expansion rapide de 1000 fois et utilisés pour des médicaments à haut débit ou le dépistage biomatériau. Ces cellules pourraient être une source plus prometteuse pour la thérapie cellulaire et les applications de la médecine régénérative.
The authors have nothing to disclose.
L'étude a été soutenue par OU-WB ISCRM, Université d'Oakland et du Michigan Head et Spine Institute. N. Beeravolu et C. McKee a reçu le Prix de recherche Graduate Provost de l'Université d'Oakland. Nous vous remercions de S. Bakshi pour la révision du manuscrit.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |