ショウジョウバエのグルーミング行動の定量
Summary
このプロトコールは、グルーミング行動を測定するための堅牢で定量的なデータをもたらす、 ショウジョウバエにおけるスケーラブルな個々のグルーミングアッセイ技術を記載する。この方法は、一定期間にわたり、無毛化された動物と不毛化した動物の体の色素蓄積の差を比較することに基づいている。
Abstract
ショウジョウバエのグルーミング行動は、前肢および後肢の両方の協調運動を必要とする複雑な多段階歩行プログラムである。ここでは、 ショウジョウバエのグルーミングの小規模または大規模の研究のいずれかのための費用対効果とスケーラビリティであるグルーミングアッセイプロトコルと新規チャンバーデザインを紹介します。ハエはブリリアントイエロー染料と体内の体から染料を除去するために与えられた時間で彼らの体のいたるところに散布されます。次に、フライを一定量のエタノール中に沈着させて色素を可溶化する。グルーミングされた動物と不毛飼育された動物の色素 – エタノール試料の相対的な吸光度を測定し、記録する。プロトコルは個々のハエの色素蓄積の定量的データをもたらし、これは容易に平均化され、サンプル間で比較され得る。これにより、実験的デザインは、突然変異動物研究または回路操作のためのグルーミング能力を容易に評価することが可能になる。この効率的な手順は、汎用性と拡張性の両方を備えています。我々はwを示すショウジョウバエ I型ドーパミン受容体（ DopR ）のためのWT動物と突然変異動物との間のプロトコルおよび比較データのork-flow。
Introduction
ショウジョウバエmelanogaster （ D. melanogaster ）のグルーミングは、複数の独立した運動プログラムの調整を含む強力な生得的な行動である1 。フルーツの飛行は、ビジョンや飛行などの正常な生理機能を阻害する可能性のあるほこり、微生物、およびその他の病原体の体を清潔にするか、または重大な免疫挑戦につながります。機械的2および免疫活性化3の両方を感知し、応答すると、十分にきれいになり、グルーミングが身体の別の部分に進行するまで、ハエはそれらの足を一緒に、または対象の身体領域上で繰り返し擦る。ハエは、主に定型パターン1,4で発生する異なる発作でグルーミング運動を行います。グルーミング信号が優先されると、行動階層が明らかになる。回路と活動のパターンは、階層の最上部にあるグルーミングプログラムが最初に発生し、その後5手入れされている身体の領域からパラレル信号を抑制FAモデル。頭部に最も高い優先順位が与えられ、次に腹部、翼部、そして最後に胸部が与えられる5 。
D. melanogasterのグルーミングプログラムは、神経回路、調節分子シグナル、および神経伝達物質を研究するための理想的なシステムです。例えば、ニューロフィブロミン機能6の妥協、 ショウジョウバエ脆弱X精神遅滞タンパク質（ dfmr1 ） 7の 喪失 、およびビスフェノールA（BPA） 8への曝露はすべて、神経線維腫症の個別のヒト症状である壊れやすいX症候群に類似した過剰なグルーミングおよび他の挙動を引き起こすシンドローム、および自閉症スペクトル障害および注意欠陥多動性障害（ADHD）の局面が含まれる。グルーミングの行動もハビツァになることができます突然変異株2を差別的に区別し、この運動プログラムを行動可塑性の研究に貸与する。 ショウジョウバエによってモデル化され得る神経学的現象の幅は、ハエが自分自身を調整する能力を測定するための新規な比較アプローチを必要とする。
小胞モノアミントランスポーターの組み合わせ作用と体内のドーパミンおよび他の生体アミンの相対的存在量は行動9、10グルーミングショウジョウバエを媒介することが示されています。オクトパミンとドーパミンは、断頭されたハエの同等の後部グルーミング活動を刺激しますが、オクトパミンの前駆物質であるチラミンもまた、より少ない程度でグルーミングを引き起こします7 。四つのドーパミン受容体はキイロショウジョウバエ 11、12、13、14で同定されています</sup>。このプロトコールに記載されているグルーミングアッセイ法を使用することにより、我々は、後天的グルーミング行動15におけるI型ファミリードーパミン受容体DopR（ DopR、dDA1、dumb ）の役割を決定した15 。
グルーミングを間接的に動物が完全マーカー色素または蛍光ダスト5、16で全体体を散布した後、グルーミングことが可能な清浄度の程度を調べることによって定量することができます。身体に残った残りの塵は、全体的な行動の相対的マーカーとして使用することができます。グルーミングするのに十分な時間が与えられた後のほこりは、グルーミング行動の特定の欠点を示している可能性がある。グルーミング調査がより広範になったので、プロトコルは、首の結合神経10に薬理学的処置を加えるための断頭、グルーミング応答2を誘発するための剛毛の触覚刺激、行動のビデオ録画15 。グルーミングの直接観察は、目視観察を使用し、特定のグルーミングイベントの頻度と期間を手作業で記録することによって、容易に研究することができます4 。
我々は、3Dプリンタまたはレーザーカッターで構築できる15ウェルのグルーミングチャンバーを設計し、青写真のデザインは再現のために利用可能である15 。この設計では、メッシュで仕切られた開口部を有する2つの接合された中央プレートと、ハエおよび/または染料がそれぞれ装填される2つの追加のスライド式上部および底部プレートとを使用する。散布したハエの草分けを許可した後、我々はそれらをエタノールに沈殿させて染料を可溶化し、この溶液の吸光度を染料の波長で測定する。複数の平行なサンプルにはプレートリーダーを使用でき、個々のサンプルにはシングルリード分光光度計を使用できます。この方法は、ハンドリングによって引き起こされる誤差を最小限にし、より小さな、コスト効率の高いスケールで実行されるグルーミングアッセイの最低水準。この方法は、温度感受性回路操作5ための加熱要素と、より大きなグルーミングチャンバを使用ジュリーシンプソンとAndrew種子、によって開拓された方法に由来し、修飾されています。以下のプロトコールは、全身の毛づくろいの定量化を示し、個々の身体部分に色素蓄積の定量化のための代替方法を示す。我々はまた、WTとDopR突然変異体の間のサンプル比較データ、およびグルーミング行動のための単純な性能指数を計算する方法を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
グルーミングアッセイは比較的簡単ですが、以下の問題に特別な注意を払うように実験者に注意します。ハエと染料を導入した後、上板と下板のネジを締めることでしっかりとシールを維持することは、再現性のある結果には不可欠です。ブリリアントイエロー染料は非常に細かく、ゆるいジョイントはチャンバーの端から染料を失うことになります。個々のウェルの色素含有量の不規則性?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この方法論とチャンバデザインのテストと確立の初期の仕事については、Brian Shepherd、Tat Udomritthiruj、Aaron Willey、Ruby Froom、Elise Pitmon、Rose Hedreenに感謝します。私たちはKelly TellezとGraham Buchanに原稿の読み書きについて感謝します。 Brilliant Yellow Dye（Sigma）の使用を提案する上での先駆的な仕事と助言と支援についてAndrew SeedsとJulie Simpsonに感謝します。この仕事は、Mary E. Groff外科医学研究および教育慈善団体、ブロンフマン科学センター、ヘルマンフェロープログラムによって一部サポートされています。
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
Riferimenti
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