Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), вирусы гриппа заражают 5-10% взрослых и 20-30% детей ежегодно и вызывает 3-5 миллионов случаев тяжелой болезни и до 500000 смертей в мире ^1. Ежегодные прививки против гриппа остаются наилучшим вариантом для предотвращения болезни. Усилия , как Глобальный план действий ВОЗ увеличились сезонного использования вакцины, потенциала для производства вакцин, а также научных исследований и разработок в более мощные стратегии вакцинации с целью снижения заболеваемости и смертности , связанных с сезонными вспышками гриппа ^2. Противовирусные препараты , такие как ингибиторы нейраминидазы (например , как занамивир и озелтамивир) доступны в некоторых странах и доказали свою эффективность в уменьшении симптомов, при введении в течение первых 48 часов от начала ^{3, 4, 5.} Несмотря на глобальные усилия, сдерживание сезонного гриппа НУtbreaks остается трудной задачей в это время, так как вирус гриппа антигенный дрейф часто превышает текущие способности адаптироваться к изменяющимся генома вируса ^6. Стратегии вакцины, направленные на новые штаммы вируса должны быть разработаны заранее, и иногда оказывается меньше, чем оптимально эффективной из-за непредвиденных изменений в типах штаммов, которые в конечном итоге преобладают в сезон гриппа. По этим причинам, существует явная необходимость разработки альтернативных терапевтических стратегий для сдерживания инфекции и снижения смертности. По достижении лучшего понимания взаимодействия хост-вируса, это может быть возможным разработать новые лекарства против гриппа и адъювантной терапии ^{7, 8.}

Человек-хозяин гриппа А взаимодействие вируса (ИФО) является сложным. Несколько моделей животных заражения человека IAV были разработаны для того, чтобы получить представление о взаимодействии хост-вирусом, ВКЛЮЧАЕТING мышей, морских свинок, крыс хлопка, хомяков, хорьков и макак ^9. Обеспечивая важные данные, которые улучшили понимание динамики хост-IAV, каждая модель организм обладает существенными недостатками, которые необходимо учитывать при попытке перевести результаты в медицине человека. Например, у мышей, которые являются наиболее широко используемой моделью, не легко разрабатывать ИФО-индуцированные симптомы инфекции при инфицировании гриппа человека изолирует ^9. Это потому , что у мышей не хватает естественный тропизм для человеческого гриппа изоляты , так как мыши эпителиальные клетки экспрессируют альфа-2,3 связей сиаловой кислоты , а не в α-2,6 связей сиаловой кислоты , выраженные на эпителиальных клетках человека ^10. Гемагглютинина белки , присутствующие в человеческом IAV изолятов выгодно связывать и входить в клетки – хозяева несущих связи альфа-2,6 сиаловой кислоты через рецептор-опосредованного эндоцитоза ^{9, 11,} </sдо> ^{12, 13.} Как следствие, в настоящее время принято, что при разработке модели мыши для гриппа человека, необходимо соблюдать осторожность, чтобы пары соответствующих штамм мыши с соответствующим штаммом вируса гриппа с целью достижения фенотипы болезни, которая резюмировать аспекты человеческой болезни. В противоположность этому , эпителиальные клетки в верхних дыхательных путей хорьков обладают альфа-2,6 связей сиаловой кислоты , которые напоминают клетки человека ^14. Зараженные хорьков разделяют многие из патологических и клинических особенностей , наблюдаемых в болезни человека, в том числе патогенности и заразности вирусов гриппа человека и птиц ^{14, 15.} Они также высоко поддаются эффективности вакцин испытаний. Тем не менее, модель хорек для человеческого гриппа имеет ряд недостатков, главным образом связанные с их размера и стоимости хозяйства, которые делают приобретение статистически знакосяка данных сложной задачей. Кроме того, хорьки воспроизведенных различия в фармакокинетики, биодоступности и токсичности, которые делают тестирование эффективности трудно. Например, хорьки проявляют токсичность по отношению к М2 ионного канала ингибитора амантадин ^16. Таким образом, очевидно, что при выборе модели на животных для изучения вопросов о инфекций Iav человека, важно учитывать его преимущества, присущие и ограничения, а также аспект хост-вирус взаимодействия, который находится под следствием.

Данио, Danio rerio, является животная модель , которая предоставляет уникальные возможности для исследования микробной инфекции, иммунного ответа хозяина, и потенциальные лекарственные терапии ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,} <вир класс = "Xref"> ^{24, 25, 26, 27, 28.} Присутствие α-2,6-связанных сиаловых кислот на поверхности клеток в данио предложил его восприимчивость к IAV, что подтвердилось в исследованиях инфекционных и изображаемого в естественных условиях с использованием флуоресцентного штамм репортер IAV ^19. В ИФО-инфицированных данио, повышенная экспрессия противовирусных ifnphi1 и MxA транскриптов показал , что врожденный иммунный ответ был стимулируется, и отображаемая ИФО-инфицированной данио, в том числе отека и деструкции ткани патология, была аналогична той , которая наблюдается при инфекциях гриппа человека , Кроме того, IAV противовирусный ингибитор нейраминидазы занамивир ограниченная смертность и снижение вирусной репликации в данио ^19.

В этом докладе, протокол для инициирования системыIC IAV инфекции у эмбрионов данио описано. Использование занамивир клинически значимых дозах в качестве доказательства из-принципа, полезность этой модели данио IAV инфекции для скрининга соединений на противовирусную активность проявляется. Кроме того, протокол , для генерации локализованного эпителиальные инфекции Iav в данио плавательном пузыре, орган , который считается анатомически и функционально аналогичны легких млекопитающих ^{21, 29, 30, 31,} описан. Используя эту локализованную модель инфекции Iav, нейтрофилы набор к месту инфекции можно отследить, что позволяет расследование роли нейтрофилов в биологии IAV инфекции и воспаления. Эти данио модели дополняют существующие модели животных инфекций Iav человека и особенно полезны для тестирования небольших молекул и реакций иммунной клетки из-за возможности расширения сtatistical мощность, емкость для умеренной до высокой пропускной способности анализов, а также способности отслеживать поведение иммунных клеток и функции со световой микроскопии.

Protocol

Все работы должны быть выполнены с использованием уровня биологической безопасности 2 (или BSL2) стандартов, описанных Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и в соответствии с директивами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитетов (IACUC). ?…

Representative Results

При этом данные , показывающие , как системная инфекция IAV в данио может быть использован для проверки эффективности лекарственного средства (рисунок 1А) предусмотрены. Эмбрионы через 48 часов после оплодотворения инъецируют APR8 (Рисунки 1C, 1F), Х-31 (ф…

Discussion

Для того, чтобы максимизировать выгоды, получаемые от использования мелких животных для моделирования человеческих хозяин-патоген взаимодействия, важно сформулировать вопросы исследования и тестирования гипотез, прописными буквами на преимущества, присущие модельной системы. В кач…

Materials

Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine- S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013