लक्षित<em> बगल में</emनवोदित खमीर में> mutagenesis Histone के जीन
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
चार मुख्य हिस्टोन प्रोटीन H2A, H2B, H3, H4 और संघनन, संगठन, और यूकेरियोटिक गुणसूत्रों के समारोह में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इन histones से प्रत्येक के दो सेट हिस्टोन octamer, एक आणविक स्पूल है कि खुद को चारों ओर डीएनए के ~ 147 आधार जोड़े की लपेटकर निर्देशन फार्म, अंततः एक nucleosome 1 के गठन में जिसके परिणामस्वरूप। Nucleosomes ऐसे जीन प्रतिलेखन के विनियमन और euchromatin के गठन और गुणसूत्रों भर हेट्रोक्रोमैटिन के रूप में गुणसूत्र आधारित प्रक्रियाओं की एक किस्म में सक्रिय भागीदारी कर रहे हैं, और इस तरह के रूप में पिछले कई दशकों के पाठ्यक्रम पर गहन अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है। तंत्र के एक नंबर वर्णित किया गया है जिसके द्वारा nucleosomes तरीके है कि विशिष्ट प्रक्रियाओं के निष्पादन की सुविधा कर सकते में हेरफेर किया जा सकता है – इन तंत्रों हिस्टोन अवशेषों की posttranslational संशोधन, एटीपी निर्भर nucleosome remodeling, और एटीपी स्वतंत्र nucleosome पुनर्गठन शामिलऔर विधानसभा / disassembly 2, 3।
नवोदित खमीर eukaryotes में हिस्टोन समारोह को समझने के लिए एक विशेष रूप से शक्तिशाली मॉडल जीव है। यह काफी हद तक डोमेन यूकेरिया भर हिस्टोन प्रोटीन के विकासवादी संरक्षण के उच्च स्तर और आनुवंशिक और जैव रासायनिक प्रयोगात्मक की एक किस्म के लिए खमीर का ज़िम्मा के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है 4 दृष्टिकोण। खमीर में रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण व्यापक रूप से क्रोमेटिन जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं पर विशेष हिस्टोन परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रयोगों के इन प्रकार के लिए यह असामान्य intracellular हिस्टोन प्रोटीन का स्तर (कारण कोशिकाओं में plasmids की संख्या अलग-अलग करने के लिए) और करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो कोशिकाओं में उत्परिवर्ती histones उनके पैतृक जीनोमिक loci से व्यक्त कर रहे हैं, स्वायत्त plasmids से अभिव्यक्ति के रूप में उपयोग करने के लिए अक्सर बेहतर है क्रोमेटिन एन के सहवर्ती परिवर्तनvironments, जो अंततः परिणामों की व्याख्या उलझाना कर सकते हैं।
यहाँ, हम एक पीसीआर आधारित तकनीक है कि उनके पैतृक जीनोमिक स्थानों है कि जीनोम में बचे हुए exogenous डीएनए दृश्यों के बिना एक कदम क्लोनिंग और वांछित उत्परिवर्तन (एस) की पीढ़ी में परिणाम की आवश्यकता नहीं है पर हिस्टोन जीन की लक्षित mutagenesis के लिए अनुमति देता है का वर्णन है। इस तकनीक को खमीर में कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रणाली का लाभ लेता है और इसी तरह की अन्य तकनीकों के अन्य समूहों द्वारा विकसित के साथ आम में कई विशेषताएं है – सबसे विशेष रूप Delitto Perfetto, साइट विशेष जीनोमिक (एसएसजी) mutagenesis, और क्लोनिंग से मुक्त पीसीआर आधारित एलील प्रतिस्थापन तरीकों 5, 6, 7। हालांकि, तकनीक का वर्णन हम एक पहलू है कि यह विशेष रूप से हिस्टोन जीन की mutagenesis के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। अगुणित खमीर कोशिकाओं में, चार कोर histones से प्रत्येक के द्वारा दो गैर-एक इनकोडिंग हैllelic और अत्यधिक मुताबिक़ जीन: उदाहरण के लिए, हिस्टोन H3 HHT1 और HHT2 जीन द्वारा इनकोडिंग है, और खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) दो जीनों की 90% से अधिक अनुक्रम में समान हैं। समरूपता के इस उच्च डिग्री के लिए विशेष mutagenesis के लिए दो हिस्टोन एन्कोडिंग जीनों में से एक को लक्ष्य बनाया गया प्रयोगों जटिल हो सकता है। जबकि ऊपर उल्लिखित तरीकों अक्सर मुताबिक़ पुनर्संयोजन ड्राइव करने के लिए लक्ष्य जीन की ओआरएफ के भीतर कम से कम कुछ दृश्यों के उपयोग की आवश्यकता, तकनीक हम यहाँ वर्णन के लिए हिस्टोन जीन की ORFs (जो हिस्सा बहुत कम अनुक्रम अनुरूपता) flanking दृश्यों का उपयोग करता है पुनर्संयोजन कदम है, इस प्रकार वांछित ठिकाना को mutagenesis के सफल लक्ष्य-निर्धारण की संभावना बढ़ रही है। इसके अलावा, मुताबिक़ क्षेत्रों है कि पुनर्संयोजन ड्राइव बहुत व्यापक हो सकता है, आगे कुशल लक्षित मुताबिक़ पुनर्संयोजन में योगदान दे।
Protocol
Representative Results
Discussion
दो गैर allelic जीन है कि अगुणित एस cerevisiae कोशिकाओं में चार मुख्य हिस्टोन प्रोटीन से प्रत्येक के लिए कोड जांचकर्ताओं जो विशेष रूप से mutagenesis के लिए दो जीनों में से एक लक्षित करना चाहते हैं के लिए एक चुनौती का प्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
Riferimenti
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