gerichte<em> In Situ</em> Mutagenese van histon genen in gist

Summary

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Abstract

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Introduction

De vier kern histon-eiwitten H2A, H2B, H3, H4 en spelen een centrale rol in de verdichting, organisatie en functie van eukaryote chromosomen. Twee sets van elk van deze histonen vormen de histon octameer, een moleculaire spoel dat de verpakking van ~ 147 basenparen van DNA rond zichzelf richt, uiteindelijk resulterend in de vorming van een nucleosoom ^1. Nucleosomen actief deel aan een verscheidenheid van chromosoom processen, zoals de regulering van gentranscriptie en de vorming van heterochromatine en euchromatine in chromosomen, en als zodanig zijn de focus van intens onderzoek in de loop van de afgelopen decennia. Een aantal mechanismen beschreven waarmee nucleosomen kan worden gemanipuleerd op een manier die uitvoering van specifieke processen vergemakkelijken – deze mechanismen omvatten posttranslationele modificatie van histon residuen, ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling en ATP-onafhankelijke nucleosoom reorganisatieen montage / demontage ^{2, 3.}

De gist Saccharomyces cerevisiae is een bijzonder krachtige modelorganisme voor het begrijpen van histone functie in eukaryoten. Dit is grotendeels te wijten aan de hoge mate van evolutionaire conservering van het histon eiwitten gehele domein Eukarya en de ontvankelijkheid van gist aan een verscheidenheid van genetische en biochemische experimentele benaderingen ^4. Omgekeerde genetische technieken in gist zijn op grote schaal gebruikt om de effecten van specifieke histon mutaties op de verschillende aspecten van chromatine biologie bestuderen. Voor deze soorten experimenten is het vaak de voorkeur om cellen waarin het mutant histonen tot expressie gebracht vanaf hun eigen genomische loci, zoals expressie van autonome plasmiden gebruik kan leiden tot abnormale intracellulaire niveaus van histon eiwitten (vanwege variërende aantallen plasmiden in cellen) en gelijktijdige wijziging van chromatine environments, die uiteindelijk de interpretatie van de resultaten kan verwarren.

Hier beschrijven we een PCR-gebaseerde techniek die het mogelijk maakt voor gerichte mutagenese van histon genen op hun oorspronkelijke genomische locaties die geen kloneringsstap en resulteert in het genereren van de gewenste mutatie (s) zonder overgebleven exogene DNA-sequenties in het genoom vereist. Deze techniek maakt gebruik van een efficiënte homologe recombinatie systeem in gist en heeft een aantal kenmerken gemeen met andere soortgelijke technieken ontwikkeld door andere groepen – vooral de Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR allel vervangingsmethoden ^{5, 6, 7.} De techniek beschrijven we de beeldverhouding dat maakt het bijzonder geschikt voor mutagenese van histon-genen. In haploïde gistcellen, elk van de vier kernhistonen wordt gecodeerd door twee niet-allelic en zeer homologe genen: bijvoorbeeld, histon H3 wordt gecodeerd door de HHT1 en HHT2 genen, en de open leesramen (ORFs) van beide genen dan 90% identiek in sequentie. Deze hoge mate van homologie kunnen experimenten ontworpen om specifiek op een van de twee-histon coderende genen voor mutagenese bemoeilijken. Dat voornoemde werkwijzen vereisen vaak het gebruik van ten minste enkele sequenties binnen het ORF van het doelwitgen homologe recombinatie drijven de techniek hier beschreven maakt gebruik van sequenties die het ORF van het histon-genen (die veel minder sequentiehomologie delen) voor de recombinatie stap, waardoor de kans op succesvolle targeting van mutagenese verhogen tot de gewenste locus. Bovendien kan de homologe gebieden die recombinatie rijden zeer omvangrijk zijn, wat verder bijdraagt ​​aan efficiënte gerichte homologe recombinatie.

Protocol

OPMERKING: De experimentele strategie voor gerichte in situ mutagenese histon-gen omvat verschillende stappen (samengevat in figuur 1). Deze stappen omvatten: (1) Vervanging van het doel histon-gen het URA3-gen, (2) Productie en zuivering van PCR-producten die overeenkomen met twee gedeeltelijk overlappende fragmenten van het doel histon-gen onder toepassing van primers die het op gewenste mutatie (s), (3 ) Fusion PCR van de twee gedeeltelijk overlappende fragmenten volledige grootte P…

Representative Results

We beschrijven het genereren van een hht2 allel tot expressie histon H3 mutant eiwit herbergen een substitutie op positie 53 van een arginine naar een glutaminezuur (H3-R53E mutant) als een representatief voorbeeld van de beoogde in situ mutagenese strategie. We genereerden een stam waarin het gehele ORF van HHT2 wordt vervangen door de URA3-gen (zie stap 1 van het protocol). Deze stam, yAAD…

Discussion

De hoge sequentie homologie tussen de twee niet-allelische genen die coderen voor elk van de vier kern histon eiwitten in S. cerevisiae haploïde cellen een uitdaging voor onderzoekers die willen specifiek op een van de twee genen voor mutagenese kan vertegenwoordigen. Eerder beschreven gist mutagenese methoden, waaronder Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR-allel vervangingsmethoden ^{5, 6,</su…}

Materials

1 kb DNA Ladder (DNA standards)	New England BioLabs	N3232L
Agarose	Sigma	A5093-100G
Boric Acid	Sigma	B0394-500G
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	R0192
EDTA solution (0.5M, pH 8.0)	AmericanBio	AB00502-01000
Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E4884-500G
Lithium acetate dihydrate	Sigma	L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler	BioRad	170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG)	Sigma	P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5X buffer	Fisher Scientific	50-443-960
Salmon sperm DNA solution	ThermoFisher Scientific	15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form)	Sigma	T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate	Sigma	236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose)	AmericanBio	AB00985-00100
Taq Polymerase and 10X Buffer	New England BioLabs	M0273X
Toothpicks	Fisher Scientific	S67859
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	AmericanBio	AB14043-01000
a-D(+)-Glucose	Fisher Scientific	AC170080025	for yeast media
Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	for yeast media
Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-2	for YPD medium
Yeast Extract	Fisher Scientific	DF0127-17-9	for YPD medium
4-aminobenzoic acid	Sigma	A9878-100G	for complete minimal dropout medium
Adenine	Sigma	A8626-100G	for complete minimal dropout medium
Glycine hydrochloride	Sigma	G2879-100G	for complete minimal dropout medium
L-Alanine	Sigma	A7627-100G	for complete minimal dropout medium
L-Arginine monohydrochloride	Sigma	A5131-100G	for complete minimal dropout medium
L-Asparagine monohydrate	Sigma	A8381-100G	for complete minimal dropout medium
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate	Sigma	A6683-100G	for complete minimal dropout medium
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880-100G	for complete minimal dropout medium
L-Glutamic acid hydrochloride	Sigma	G2128-100G	for complete minimal dropout medium
L-Glutamine	Sigma	G3126-100G	for complete minimal dropout medium
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma	H8125-100G	for complete minimal dropout medium
L-Isoleucine	Sigma	I2752-100G	for complete minimal dropout medium
L-Leucine	Sigma	L8000-100G	for complete minimal dropout medium
L-Lysine monohydrochloride	Sigma	L5626-100G	for complete minimal dropout medium
L-Methionine	Sigma	M9625-100G	for complete minimal dropout medium
L-Phenylalanine	Sigma	P2126-100G	for complete minimal dropout medium
L-Proline	Sigma	P0380-100G	for complete minimal dropout medium
L-Serine	Sigma	S4500-100G	for complete minimal dropout medium
L-Threonine	Sigma	T8625-100G	for complete minimal dropout medium
L-Tryptophan	Sigma	T0254-100G	for complete minimal dropout medium
L-Tyrosine	Sigma	T3754-100G	for complete minimal dropout medium
L-Valine	Sigma	V0500-100G	for complete minimal dropout medium
myo-Inositol	Sigma	I5125-100G	for complete minimal dropout medium
Uracil	Sigma	U0750-100G	for complete minimal dropout medium
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500	for complete minimal dropout medium
Yeast Nitrogen Base	Fisher Scientific	DF0919-07-3	for complete minimal dropout medium
5-Fluoroorotic acid (5-FOA)	AmericanBio	AB04067-00005	for  5-FOA medium