Targeted<em> In situ</em> mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
Las cuatro proteínas histonas H2A, H2B, H3, H4 y juegan un papel central en la compactación, la organización y función de los cromosomas eucarióticos. Dos juegos de cada una de estas histonas forman el octámero de histona, un carrete molecular que dirige la envoltura de ~ 147 pares de bases de ADN en torno a sí mismo, en última instancia, resulta en la formación de un nucleosoma 1. Nucleosomas son participantes activos en una variedad de procesos basados en los cromosomas, tales como la regulación de la transcripción de genes y la formación de eucromatina y heterocromatina en todos los cromosomas, y como tales han sido el foco de intensa investigación en el transcurso de las últimas décadas. Varios mecanismos han sido descritos por el cual los nucleosomas se pueden manipular de manera que puedan facilitar la ejecución de los procesos específicos – Estos mecanismos incluyen la modificación postraduccional de residuos de histonas, nucleosoma remodelación dependiente de ATP, y la reorganización de nucleosomas independiente de ATPy montaje / desmontaje 2, 3.
La levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelo particularmente poderosa para la comprensión de la función de la histona en eucariotas. Esto puede atribuirse en gran parte al alto grado de conservación evolutiva de las proteínas histonas en todo el dominio Eukarya, y la flexibilidad de la levadura a una variedad de genética y bioquímica experimental se acerca 4. enfoques inversa genéticos en levadura se han usado ampliamente para estudiar los efectos de las mutaciones de histona específicas sobre diversos aspectos de la biología de la cromatina. Para estos tipos de experimentos a menudo es preferible usar células en las que las histonas mutantes se expresan a partir de sus loci genómico nativo, como la expresión de plásmidos autónomos puede conducir a niveles anormales intracelulares de proteínas histonas (debido a un número variable de plásmidos en las células) y alteración concomitante de la cromatina environments, que en última instancia pueden confundir la interpretación de los resultados.
A continuación, describimos una técnica basada en PCR que permite la mutagénesis dirigida de los genes de histonas en sus ubicaciones genómicas nativas que no requiere una etapa de clonación y los resultados en la generación de la mutación (s) deseado sin secuencias de ADN exógeno sobrantes en el genoma. Esta técnica se aprovecha del sistema de recombinación homóloga eficiente en la levadura y tiene varias características en común con otras técnicas similares desarrollados por otros grupos – sobre todo la Delitto Perfetto, mutagénesis genómica específica del sitio (SSG), y la clonación de libre alelo basado en la PCR métodos de reemplazo de 5, 6, 7. Sin embargo, la técnica descrita tiene un aspecto que hace que sea especialmente adecuado para la mutagénesis de genes de histonas. En células de levadura haploides, cada una de las cuatro histonas del núcleo está codificada por dos no unagenes llelic y altamente homólogas: por ejemplo, la histona H3 se codifican por los genes HHT1 y HHT2, y los marcos de lectura abierta (ORFs) de los dos genes son más del 90% idénticos en secuencia. Este alto grado de homología puede complicar los experimentos diseñados para dirigirse específicamente a uno de los dos genes de histonas que codifica para la mutagénesis. Considerando que los métodos antes mencionados a menudo requieren el uso de al menos algunas secuencias dentro de la ORF del gen diana para conducir la recombinación homóloga, la técnica que describimos aquí hace uso de secuencias que flanquean el ORF de los genes de histonas (que comparten mucho menos homología de secuencia) para la etapa de recombinación, aumentando así la probabilidad de que la orientación con éxito de mutagénesis para el locus deseado. Por otra parte, las regiones homólogas que dirigen la recombinación puede ser muy extensa, lo que contribuye a la eficiente recombinación homóloga dirigida.
Protocol
Representative Results
Discussion
El alto grado de homología de secuencia entre los dos genes no alélicos que codifican para cada una de las cuatro proteínas histonas en células haploides de S. cerevisiae puede representar un reto para los investigadores que desean dirigirse específicamente a uno de los dos genes para la mutagénesis. Anteriormente se ha descrito metodologías de mutagénesis de levadura, incluyendo la Delitto Perfetto, mutagénesis genómica específica del sitio (SSG), y métodos de reemplazo de alelo basados en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
Riferimenti
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