Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren gonadale weefsel van larvale zebravis, die onderzoeken zebravis geslachtsdifferentiatie en het onderhoud vergemakkelijkt.

Abstract

Hoewel wild zebravis hebben een ZZ / ZW sex-bepalingssysteem werden geacclimatiseerd zebravis het geslacht chromosoom verloren. Ze maken gebruik van een polygene geslachtsbepaling systeem, waarbij meerdere genen verspreid over het genoom gezamenlijk het geslacht identiteit exemplaren bepalen. Momenteel is de genen die betrokken zijn bij het reguleren van gonade ontwikkeling en hoe ze werken blijven ongrijpbaar. Normaal gesproken, het isoleren van gonadale weefsel is de eerste stap om het geslacht ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Hier presenteren we een procedure om gonadale weefsel te isoleren van 17 dpf (dagen na de bevruchting) en 25 dpf zebravis larven. De geïsoleerde gonadale weefsel kan vervolgens worden onderzocht door morfologie en genexpressie profilering.

Introduction

De belangrijkste vrouwelijke geslacht determinant in het wild levende zebravis chromosoom 4 is verloren of gewijzigd in de gedomesticeerde zebravis (dwz gemeenschappelijke lab stammen) ^1. In plaats daarvan hebben ze een polygene geslachtsbepaling systeem vergezeld door omgevingsfactoren zoals temperatuur, hypoxie, voedselbeschikbaarheid en bevolkingsdichtheid. De gedetailleerde mechanismen van de zebravis sex ontwikkeling worden niet volledig begrepen. Fundamentele vragen zoals wanneer zebravis geslachtsbepaling optreedt, wat de primaire geslachtsbepaling signaal (s) is / zijn, en welke genen reguleren de eerste stap van gonade omzetting nog worden beantwoord ^{2, 3.}

In het proces van zebravis seks ontwikkeling, hebben een aantal belangrijke stadia erkend. In de vroege fase van ontwikkeling, uitgaande van 4 HPF (uur na bevruchting) primordiale kiemcellen (PGC) ondergaan specificatie, migratie en genitale ridgeproliferatie. PGC aantallen en onderlinge interacties tussen kiemcellen en somatische cellen zijn belangrijk voor differentiatie ⁴ gonaden. Op 13 dpf (dagen na de bevruchting), de geslachtsklieren zijn in de ongedifferentieerde fase. Uiterlijk op 17 dpf, de geslachtsklieren zich ontwikkelen tot bi-potentieel eierstokken in zowel de toekomstige vrouwen en mannen. De apoptose-afhankelijke overgang van de eierstok naar de testis beginnen bij 21 tot 25 dpf en kunnen gedurende een aantal weken. Met 35 dpf, heeft het geslacht van de gonaden bepaald en geslacht-specifieke productie van gameten gang in beide eierstokken en testes ^{5, 6, 7.}

Tot op heden hebben diverse kandidaat-genen en mechanismen van geslachtsbepaling voorgesteld. Proteoomanalyse en transcriptoom analyse hebben veel genen die seksueel dimorfe expressie en deze genen zijn gebruikt om geslachtsdifferentiatie studie in zebravis ^8, </sup> ^{9, 10.} Bijvoorbeeld, in larvale zebravis, de cyp19a1a gen specifiek tot expressie gebracht in de eierstok maar niet in de testis ^{11, 12.} Bovendien wordt AMH gen zwak tot expressie gebracht in de follikel granulosa cellen, maar sterk testis Sertoli cellen ^13. Daarentegen wordt vasa gen continu tot expressie gebracht in de geslachtscellen van zowel vrouwelijke als mannelijke zebravis, waardoor het een geschikte gonade marker ^{14, 15.}

Onderzoeken gonadale genexpressieniveaus is cruciaal voor het moleculaire mechanisme van de geslachtsbepaling en differentiatie begrijpen name de bi-potentiaal eierstok fase ^{3, 9.} De geringe omvang van larvale zebravis en dienovereenkomstig kleine gonaden compliceren de isolatie van gonadal weefsel voor verdere moleculaire analyse. Eerdere studies gebruikt ontleed gehele heupgebied tussen opercula en anale poriën ^16. Dit preparaat hoewel bevattende geslachtsklieren, bestaat uit meerdere weefsels en organen. Als alternatief kunnen transgene dieren met gonaden-specifiek GFP expressie zoals vasa: EGFP werden voor gonaden weefsel isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en laser capture microdissectie ^{17, 18.} Maar hun wijdverbreide toepassing is beperkt. We beschrijven hier een eenvoudige procedure om gonaden weefsel te isoleren van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. We tonen de positie van de geslachtsklieren met betrekking tot andere organen en isoleer de morfologisch intact geslachtsklieren uit de omliggende weefsels. We de gonaden-specifieke genen zoals vasa en cyp19a1a tonen verder zijn sterk tot expressie gebracht in de geïsoleerde geslachtsklieren opzichte van de romp weefsel door kwantitatieve PCR (qPCR) analyse. Het huidige protocol maakt de identificatie, isolatie, zuivering en RNA-amplificatie van specifieke gonadale genen van larvale zebravis, waardoor verdere moleculaire analyse gonadale weefsel ¹⁹ mogelijk.

Protocol

Zebravis experimenten werden goedgekeurd door de Fudan University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Zebravis zijn gerezen en gekweekt volgens standaardwerkwijzen 20. 1. Voorbereidingen Cultiveren 17 dpf en 25 dpf larvale zebravis Transfer 2 mannelijke en 2 vrouwelijke volwassen zebravissen (gezond, 3 tot 6 maanden oud, laboratorium AB-stam) tot een kruispunt tank in de late namiddag voor de kruising dag. Scheid de mannen en vrouwen met e…

Representative Results

Dissecties van de geslachtsklieren werden uitgevoerd op AB stam larvale zebravis. Figuur 1 toont typische gonadale weefsel van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. Eerst wordt de huid en de spieren van een zijde van de buik gesneden om de interne organen bloot. Na verwijdering van de massa van inwendige organen, de zwemblaas met de gonaden blijven in de kofferbak. De gonaden werd aan de ventrale zijde van zwemblaas (pijl in figuur …

Discussion

De zebravis is uitgegroeid tot een krachtig model en wordt veelvuldig gebruikt in de ontwikkeling en ziekte-gerelateerd onderzoek. De methoden voor het isoleren van organen bij volwassen zebravis, zoals hersenen, hart, gonade, en nieren, zijn goed gedocumenteerd ^{23, 24, 25.} Als gevolg van de kleine omvang en dynamische herinrichting van de gonadale weefsels in het larvale zebravis, isolatie van gonadale weefsel is een uitdagend…

Materials

Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	For embryo incubation
20 X EM			For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O.
1 X EM			Dilute 20 X EM in distilled water
AGAROSE G-10	Gene	121985	For preparing the 2% agar plates
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	For RNA isolation
Meter glass	Shen Bo	250 ml	For preparing the 2% agar plates
Microwave Oven	Midea	M1-211A	For heating the AGAR
TWEEZER DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissection
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	For dissection
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	For photomicrograph
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	For DNA digestion in the RNA solution
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	For  first-strand cDNA synthesis
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	gene expression profiling