幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖
Summary
ここでは、ゼブラフィッシュの性分化とメンテナンスの調査を容易にするであろう幼虫のゼブラフィッシュの生殖腺組織を単離するためのプロトコルを提示します。
Abstract
野生のゼブラフィッシュは、ZZ / ZWセックス決意システムを有するが、飼いならされたゼブラフィッシュは、性染色体を失っています。彼らは、ゲノム全体に分布するいくつかの遺伝子は、まとめて、個々の魚の性同一性を決定多遺伝子性別決意システムを利用します。現在、生殖腺の発達の調節に関与する遺伝子とその仕組みは、とらえどころのないまま。通常、生殖腺組織を分離することは、セックスの発生過程を調べるための最初のステップです。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫DPF 17 DPF（日受精後）と25からの性腺組織を分離するための手順を提示します。単離された生殖腺組織は、その後、形態学および遺伝子発現プロファイリングによって調べることができます。
Introduction
野生のゼブラフィッシュ4染色体の主要な女性セックス行列は、1（ すなわち 、共通の実験室株）を紛失したり、飼いならされたゼブラフィッシュに変更されます。代わりに、彼らは、温度、低酸素症、食品の可用性と人口密度などの環境要因を伴う多遺伝子のセックス決意システムを持っています。ゼブラフィッシュのセックス開発の詳細なメカニズムは完全には理解されていません。プライマリ性別決意信号（単数または複数）/何であるか、そのようなゼブラフィッシュ性別決意が発生した場合のように基本的な質問は、であり、遺伝子は、生殖腺の変換の最初のステップは、3 2 に答えされずに残って調節います。
ゼブラフィッシュのセックス、開発の過程では、いくつかの重要な段階では認識されています。開発の初期段階では、4 HPF（時間後に受精）始原生殖細胞（始原生殖細胞）仕様を受け、から出発して生殖隆起に移動および増殖。 PGC番号と生殖細胞と体細胞間の相互の相互作用は、生殖腺の分化4のために重要です。 13 DPF（日受精後）では、生殖腺は、未分化段階にあります。 17のDPFすることにより、生殖腺は、将来、女性と男性の両方における双方向性卵巣へと発展します。卵巣からの精巣にアポトーシス依存遷移は21〜25 DPFから始まり、数週間継続することができます。 35のDPFにより、生殖腺の性別が決定されており、性別特異的配偶子生産は両方の卵巣に進行中であると5精巣、6、7。
現在まで、多様な候補遺伝子とセックス決意のメカニズムが提案されています。プロテオミクスとトランスクリプトーム解析は、性的二型表現で多くの遺伝子を単離したこれらの遺伝子は、ゼブラフィッシュ8に性分化を研究するために利用されてきました</sup> 9、10。例えば、幼生ゼブラフィッシュでは、cyp19a1a遺伝子は特になく、精巣11,12における卵巣において発現されます。また、AMH遺伝子が弱く卵胞顆粒膜細胞で発現するが、強く精巣のセルトリ細胞13れます。対照的に、Vasa遺伝子は、連続的に適切な性腺マーカー14、15作り、女性と男性の両方ゼブラフィッシュの生殖細胞において発現されます。
性腺遺伝子発現レベルを調べることは、特に双電位卵巣ステージ3,9に性別決意と分化の分子機構を理解することが重要です。しかし、幼虫のゼブラフィッシュおよび対応小さな生殖腺のサイズが小さいgonadaの単離を複雑さらなる分子分析のためにL組織。以前の研究では、operculaと肛門の気孔16との間の解剖全体のトランク域を使用しました。この準備は、生殖腺を含むが、複数の組織や器官から構成されています。あるいは、脈などの生殖腺特異的GFP発現を有するトランスジェニック動物：EGFPの蛍光活性化細胞選別（FACS）およびレーザー捕捉マイクロ切開17、18 を介して、性腺組織単離のために使用しました。しかし、彼らの広範なアプリケーションが限られています。ここでは、17 DPFと25 DPFの幼虫のゼブラフィッシュからの性腺組織を分離するための簡単な手順について説明します。我々は、他の器官に対する生殖腺の位置を示し、周囲の組織から形態学的に無傷の生殖腺を分離します。我々はさらに、（例えばヴァーサとcyp19a1aなどの生殖腺特異的遺伝子は高度に定量的PCRを介してトランク組織と比較して、単離された生殖腺で発現される表示します定量PCR）分析。本プロトコルは、それによって性腺組織19のその後の分子分析を可能にする、幼生ゼブラフィッシュから生殖腺特異的遺伝子の同定、単離、RNAの精製及び増幅を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、強力なモデルとなっており、広範囲の開発と疾患関連研究に使用されています。例えば、脳、心臓、生殖腺、腎臓などのアダルトゼブラフィッシュにおける臓器の単離のための方法は、ウェル23、24、25を文書化されています。小型及び幼虫のゼブラフィッシュにおける生殖組織の動的再造形に、生殖…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、魚のケアのためのCチャンに感謝します。この作品は、中国の国家自然科学基金（GPへ31171074、31371099と31571067）によって及び浦江タレントプロジェクト（GPへ09PJ1401900）によってサポートされていました。
Materials
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
| 1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
References
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