लार्वा zebrafish जननांगों ऊतक के विच्छेदन
Summary
यहाँ, हम लार्वा zebrafish, जो zebrafish सेक्स भेदभाव और रखरखाव की जांच सुविधा होगी की जननांगों ऊतक अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
यद्यपि जंगली zebrafish एक ZZ / ZW सेक्स-निर्णय प्रणाली के अधिकारी, पालतू zebrafish सेक्स गुणसूत्र खो दिया है। वे एक polygenic लिंग निर्धारण प्रणाली, जहां कई जीनों वितरित भर जीनोम सामूहिक रूप से अलग-अलग मछली की सेक्स पहचान का निर्धारण का उपयोग करें। वर्तमान में, जीन जननपिंड विकास के विनियमन में शामिल और वे कैसे काम मायावी रहते हैं। आम तौर पर, जननांगों ऊतक अलग सेक्स विकास प्रक्रियाओं की जांच के लिए पहला कदम है। यहाँ, हम 17 DPF (दिनों के बाद निषेचन) और zebrafish लार्वा DPF 25 से जननांगों ऊतक अलग करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। पृथक जननांगों ऊतक बाद में आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा से जांच की जाए।
Introduction
जंगली zebrafish 4 गुणसूत्र में प्रमुख महिला सेक्स निर्धारक 1 खो दिया है या पालतू zebrafish में संशोधित किया गया है (यानी आम प्रयोगशाला उपभेदों)। इसके बजाय, वे एक polygenic लिंग निर्धारण प्रणाली जैसे तापमान, हाइपोक्सिया, भोजन की उपलब्धता और जनसंख्या घनत्व के रूप में पर्यावरणीय कारकों के साथ की है। zebrafish सेक्स विकास का विस्तृत तंत्र पूरी तरह नहीं समझा। जैसे कि जब zebrafish लिंग निर्धारण होता है के रूप में बुनियादी सवाल, प्राथमिक लिंग निर्धारण संकेत (ओं) / क्या है, और जो जीन को विनियमित जननपिंड परिवर्तन की दिशा में पहला कदम 2 जवाब देना, 3 रहते हैं।
zebrafish सेक्स विकास की प्रक्रिया में, कई महत्वपूर्ण चरणों मान्यता दी गई है। विकास के प्रारंभिक चरण में, 4 hpf (घंटे के बाद निषेचन) मौलिक जर्म कोशिकाओं (PGCs) विनिर्देश से गुजरना, से शुरू जननांग रिज करने के लिए प्रवास औरप्रसार। पीजीसी संख्या और जर्म कोशिकाओं और दैहिक कोशिकाओं के बीच पारस्परिक बातचीत जननपिंड भेदभाव 4 के लिए महत्वपूर्ण हैं। 13 DPF (दिनों के बाद निषेचन) में जननांग undifferentiated चरण में है। 17 DPF करके, जननांग भविष्य दोनों महिलाओं और पुरुषों में द्वि-संभावित अंडाशय में विकसित। वृषण को अंडाशय से apoptosis पर निर्भर संक्रमण 21 से 25 DPF पर शुरू करते हैं और कई हफ्तों के लिए जारी रख सकते हैं। 35 DPF करके, जननपिंड का लिंग निर्धारित किया गया है और सेक्स-विशेष युग्मक उत्पादन दोनों अंडाशय में चल रहा है और 5 वृषण, 6, 7।
तिथि करने के लिए, विविध उम्मीदवार जीनों और लिंग निर्धारण के तंत्र प्रस्तावित किया गया है। प्रोटिओमिक्स और transcriptomic विश्लेषण यौन dimorphic अभिव्यक्ति के साथ कई जीनों पृथक कर दिया है और इन जीनों zebrafish 8 में सेक्स भेदभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है, </sup> 9, 10। उदाहरण के लिए, लार्वा zebrafish में, cyp19a1a जीन विशेष रूप से अंडाशय में व्यक्त किया है लेकिन वृषण 11, 12 में नहीं है। इसके अलावा, AMH जीन कमजोर डिम्बग्रंथि कूप ग्रान्युलोसा कोशिकाओं में व्यक्त किया है, लेकिन दृढ़ता से वृषण सर्टोली कोशिकाओं 13 में। इसके विपरीत, वासा जीन लगातार दोनों महिला और पुरुष zebrafish के जर्म कोशिकाओं में व्यक्त किया है, यह एक उपयुक्त जननपिंड मार्कर 14, 15 बना रही है।
जननांगों जीन अभिव्यक्ति के स्तर की जांच विशेष रूप से द्वि-संभावित अंडाशय चरण 3, 9 में लिंग निर्धारण और भेदभाव की आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, लार्वा zebrafish और तदनुसार छोटे जननांग के छोटे आकार gonada के अलगाव को मुश्किलआगे आणविक विश्लेषण के लिए एल ऊतक। पिछला इस्तेमाल किया पढ़ाई opercula और गुदा छेद 16 के बीच पूरे ट्रंक क्षेत्र विच्छेदित। यह तैयारी है, हालांकि जननांग युक्त, कई ऊतकों और अंगों के होते हैं। वैकल्पिक रूप से, वासा के रूप में जननपिंड विशेष GFP अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों: EGFP प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदन 17, 18 के माध्यम से जननांगों ऊतक अलगाव के लिए इस्तेमाल किया गया। लेकिन उनकी व्यापक प्रयोग सीमित है। यहाँ, हम 17 DPF और 25 DPF पर लार्वा zebrafish से जननांगों ऊतक अलग करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन। हम अन्य अंगों के संबंध में जननांग की स्थिति का प्रदर्शन और आसपास के ऊतकों से आकृति विज्ञान बरकरार जननांग को अलग। हम आगे अत्यधिक मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से ट्रंक ऊतक (के साथ तुलना में अलग जननांग में व्यक्त कर रहे इस तरह के वासा और cyp19a1a रूप जननपिंड-विशिष्ट जीन दिखानेqPCR) विश्लेषण। वर्तमान प्रोटोकॉल जिससे जननांगों ऊतक 19 के बाद के आणविक विश्लेषण को सक्षम करने की पहचान, अलगाव, शाही सेना शुद्धि और लार्वा zebrafish से जननांगों विशिष्ट जीन की प्रवर्धन अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
zebrafish एक शक्तिशाली मॉडल बन गया है और बड़े पैमाने पर विकास और रोग से संबंधित अनुसंधान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है। इस तरह के मस्तिष्क, हृदय, जननपिंड, और गुर्दे के रूप में वयस्क zebrafish में अंगों के अलगाव ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मछली की देखभाल के लिए सी जांग धन्यवाद। यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31171074, 31371099 और 31571067 जीपी के लिए) द्वारा और Pujiang प्रतिभा परियोजना (09PJ1401900 जीपी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
| 1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
References
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