El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables
Summary
Este artículo presenta una serie de protocolos para el desarrollo de células modificadas y las superficies funcionalizadas que permiten sintéticamente por ingeniería genética de E. coli para controlar y manipular las superficies de materiales programables.
Abstract
Hemos desarrollado una interfaz abiótico-bióticos que permite a las células por ingeniería genética para el control de las propiedades materiales de una superficie funcionalizada. Este sistema se hace mediante la creación de dos módulos: una cepa sintéticamente ingeniería de células de E. coli y una interfaz de material funcionalizado. Dentro de este manuscrito detallamos un protocolo para la ingeniería genética de los comportamientos seleccionados dentro de una cepa de E. coli usando las estrategias de clonación molecular. Una vez desarrollado, esta cepa produce niveles elevados de biotina cuando se expone a un inductor químico. Adicionalmente, detalle protocolos para la creación de dos superficies funcionalizadas diferentes, cada uno de los cuales es capaz de responder a la biotina sintetizada por células. Tomados en conjunto, se presenta una metodología para la creación de un sistema enlazado, abiótico-bióticos que permite que las células para controlar la composición del material y montaje en sustratos inertes ingeniería.
Introduction
Aquí, se presenta los procedimientos para desarrollar un sustrato programable capaz de responder a una señal química a partir de una línea celular diseñada. 1 Hacemos esto mediante la creación de una interfaz de biotina-estreptavidina que responde a la biotina producida por las células sintéticamente ingeniería Escherichia coli (E. coli). Anteriormente, las superficies programables han sido diseñados para una amplia gama de aplicaciones, desde la detección de la toxina 2 y en el punto de atención de diagnóstico 3 con la defensa y la seguridad. 4 Mientras superficies programables pueden ser útiles como sensores y actuadores, que se pueden hacer más "inteligente" dotándolos de la capacidad de adaptarse a diferentes retos medioambientales. Por el contrario, incluso los microorganismos simples, tales como E. coli, tienen la capacidad de adaptación inherente y son capaces de responder a los desafíos con soluciones sofisticadas y, a menudo inesperados. Esta adaptabilidad ha permitido E.poblaciones coli, controladas por sus redes de genes complejos, de manera rentable buscar recursos, 5 crear productos de valor añadido, 6 e incluso potencia robótica micro-escala. 7 Mediante el acoplamiento de las ventajas adaptativas de las células vivas con el uso de superficies programables, podemos crear un sustrato inteligente capaz de dar respuesta a diferentes condiciones ambientales.
La biología sintética ha dado a los investigadores nuevas habilidades para programar el comportamiento de los organismos vivos. Mediante el diseño de las células que contienen las redes de regulación de genes nuevos, los investigadores pueden diseñar células que exhiben una gama de comportamientos programados. 8, 9 Más allá de la investigación básica, estos comportamientos pueden ser utilizados para aplicaciones tales como el control conjunto de materiales y biológicamente la producción de productos de valor añadido. 10 En esto, nos detalle la forma en que utilizamos las herramientas de la biología sintética para bañogineer una cepa de E. coli que sintetiza la biotina a la inducción. Esta cepa se desarrolló mediante el uso de métodos de clonación de enzimas de restricción para montar un plásmido, pKE1-lacI-bioB. Este plásmido, cuando se transforma en la cepa de E. coli K-12 MG1655, dota a las células con la capacidad de expresar niveles elevados de bioB, una enzima esencial para la síntesis de la biotina. Cuando se indujeron células transformadas con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y provisto de un precursor de biotina, destiobiotina (DTB), se produjeron niveles elevados de biotina.
interacción de unión de biotina con estreptavidina es uno de los enlaces más fuertes no covalentes que se encuentran en la naturaleza. Como tal, la interacción biotina-estreptavidina es a la vez bien caracterizado y altamente empleado en la biotecnología. 11 Dentro de este manuscrito, se presentan dos estrategias que emplean la interacción biotina-estreptavidina para detectar y detectar la biotina producida por células con una superficie funcionalizada. Nosotrosreferirse a estas superficies contrastantes como los esquemas de control "indirectos" y "directos". En el esquema de control indirecto, la biotina producida por células compite con biotina que se ha conjugado e inmovilizado en una superficie de poliestireno para estreptavidina sitios de unión. Además, la estreptavidina está conjugado con peroxidasa de rábano (HRP). HRP modifica 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbencidina (TMB), para producir una señal óptica, 12 que pueden ser controlados mediante la cuantificación de la absorbancia espectral (es decir, densidad óptica) a 450 nm (OD 450). Por lo tanto, el esquema de control indirecto permite a los investigadores medir la biotina producida por células mediante el control de la atenuación de la señal de OD 450.
El esquema de control directo explota el caso de estreptavidina-biotina mediante la inmovilización de estreptavidina directamente a una superficie del material y permitiendo que la biotina producida por células y HRP biotinilada para competir por los sitios de unión de estreptavidina. Una vez más, lalos niveles relativos de biotina producida por células son monitoreados mediante la medición de una señal OD 450.
En su conjunto, las células modificadas y las superficies funcionalizadas nos permiten controlar las propiedades de una superficie programable mediante la inducción de las redes en las células vivas. En otras palabras, hemos creado un sistema que aprovecha la capacidad de adaptación de los organismos vivos y la fiabilidad y la especificación de una interfaz material de ingeniería mediante la vinculación de estos sistemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado una nueva estrategia para interconectar células modificadas que viven con una superficie de material funcionalizado. Esto se logró mediante el desarrollo de una línea celular capaz de sintetizar niveles elevados de biotina cuando se induce con IPTG. Los niveles elevados de biotina pueden entonces ser utilizados para modificar la superficie funcionalizada. Los protocolos detallados de cómo la ingeniería de la línea de células de E. coli y cómo crear dos superficies funcionalizadas difere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo de la adjudicación FA9550-13-1-0108 de la Fuerza Aérea Oficina de Investigación Científica de los EE.UU.. Los autores reconocen, además, el apoyo de la adjudicación N00014-15-1-2502 de la Oficina de Investigación Naval de los EE.UU., la financiación del Instituto de Tecnología crítico y Ciencias Aplicadas en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad del Estado, y de la Fundación Nacional de Ciencia de Graduados de Investigación Programa de Becas, adjudicación número 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
Riferimenti
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