באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות
Summary
מאמר זה מציג סדרה של פרוטוקולים לפיתוח תאים מהונדסים ומשטחים פונקציונליים המאפשרים מהונדס חיידק סינטטי לשלוט ולטפל משטחי חומר לתכנות.
Abstract
פתחנו ממשק אביוטי-ביוטיים המאפשר תאים מהונדסים לשלוט בתכונות החומר של משטח פונקציונלי. מערכת זו נעשית על ידי יצירת שני מודולים: זן מהונדס סינטטי של תאי חיידק וממשק חומר פונקציונלי. בתוך נייר זה, אנו פרטנו פרוטוקול עבור גנטית הנדסת התנהגויות נבחרות בתוך זן של חיידק באמצעות אסטרטגיות שיבוט מולקולריות. לאחר שפותח, זן זה מייצר רמות גבוהות של ביוטין כאשר הם נחשפים inducer כימי. בנוסף, אנו פרוטוקולי פרט ליצירת שני משטחים פונקציונליים שונים, שכל אחת מהן מסוגלת להגיב ביוטין תא-מסונתז. יחדיו, אנו מציגים מתודולוגיה ליצירה צמודה, מערכת אביוטי-ביוטיים המאפשר מהונדסת תאים לשלוט רכב חומר והרכבה על מצעים דוממים.
Introduction
כאן אנו מדווחים בנהלי פיתוח מצע לתכנות מסוגל להגיב אות כימית מן קו תא מהונדס. 1 אנו עושים זאת על ידי יצירת ממשק streptavidin ביוטין שמגיב ביוטין מיוצר על ידי coli Escherichia המהונדס סינטטי (E. coli) תאים. בעבר, משטחים לתכנות כבר מהונדסים עבור מגוון רחב של יישומים מ זיהוי הרעלן 2 ונקודה של טיפול אבחון 3 עד הגנה וביטחון. 4 בעוד משטחים לתכנות יכולים להיות שימושיים כמו חיישנים ומפעיל, הם יכולים להיעשות "חכמים" על ידי להנחיל להם את היכולת להסתגל לאתגרים סביבתיים שונים. לעומת זאת, אפילו מיקרואורגניזמים פשוטים, כגון E. coli, יש הסתגלות טמונה ומסוגלים להגיב לאתגרים עם פתרונות מתוחכמים ולעתים קרובות בלתי צפויים. הסתגלות זו אפשרה E.אוכלוסיות coli, בשליטת רשתות גנים המורכבים שלהן, חסכונית לחפש משאבים, 5 ליצור מוצרים בעלי ערך מוסף, 6 ואפילו רובוטיקה כוח בקנה מידה מיקרו. 7 על ידי צימוד היתרונות אדפטיבית של תאי חיים עם שימוש משטחים לתכנות, נוכל ליצור מצע חכם מסוגל להגיב לתנאי סביבה שונים.
ביולוגיה סינתטית נתן החוקרים יכולות חדשות כדי לתכנת את ההתנהגות של היצורים החיים. באמצעות הנדסה לתאים להכיל רשתות רגולטוריות גן חדש, חוקרים יכולים לעצב תאים כי תערוכה מגוונת של התנהגויות מתוכנות. 8, 9 מעבר מחקר בסיסי, התנהגויות אלו עשויות לשמש ליישומים כגון שליטת הרכבת חומר ביולוגי לייצר מוצרים בעלי ערך מוסף. 10 בזאת, אנו בפירוט כיצד השתמשנו בכלים של ביולוגיה סינתטית כדי engineer זן החיידק כי מסנתז ביוטין על אינדוקציה. זן זה פותח באמצעות שיטות שיבוט אנזים הגבלה להרכיב פלסמיד, pKE1-לאצי-bioB. פלסמיד זה, כאשר הפך K-12 זן E. coli MG1655, מעניק לתאים עם יכולת להביע רמות גבוהות של bioB, אנזים חיוני לסינתזת ביוטין. כאשר תאים שהשתנו היו מושרים עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ובתנאי עם מבשר ביוטין, desthiobiotin (DTB), רמות גבוהות של ביוטין יוצרו.
האינטראקציה המחייבת של ביוטין עם streptavidin היא אחת איגרות החוב הלא-קוולנטיים החזקים המצויים בטבע. ככזה, האינטראקציה streptavidin ביוטין הוא גם היטב מאופיין והעסיק מאוד בביוטכנולוגיה. 11 בתוך כתב היד הזה, אנו מציגים שתי אסטרטגיות העסקת אינטראקצית streptavidin ביוטין לחוש ולזהות ביוטין בייצור תאים עם משטח פונקציונלי. אָנוּמתייחסים משטחים מנוגדים אלה תוכניות שליטה "עקיפה" ו "ישירה". בתכנית השליטה העקיפה, ביוטין-מיוצר תא מתחרה עם ביוטין כי כבר מצומדות ו משותק על משטח קלקר streptavidin אתרי קישור. בנוסף, streptavidin הוא מצומדות עם peroxidase חזרת (HRP). HRP משנה 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB), להפקת אותות אופטיים, 12 אשר עשוי להיות במעקב על ידי לכימות ספיגת ספקטרלי (כלומר, צפיפות אופטית) ב -450 ננומטר (OD 450). לפיכך, את ערכת השליטה העקיפה מאפשרת לחוקרים למדוד ביוטין בייצור תאים על ידי ניטור attentuation של אות OD 450.
ערכת השליטה הישירה מנצלת את האירוע ביוטין-streptavidin על ידי streptavidin משתק ישירות משטח חומר ומאפשר ביוטין תא-פיק biotinylated HRP להתחרות על streptavidin אתרי קישור. שוב,רמות יחסיות של ביוטין בייצור התאים מנוטר על ידי מדידת אות OD 450.
יחדיו, התאים המהונדסים משטחים פונקציונליים מאפשרים לנו לשלוט על התכונות של משטח לתכנות על ידי גרימת רשתות בתאים חיים. במילים אחרות, יצרנו מערכת שמנצלת את יכולת ההתאמה של היצורים החיים ואת אמינות מפרט של ממשק חומר מהונדס ידי קישור המערכות הללו יחד.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו אסטרטגיה חדשה עבור התממשקות תאים מהונדסים חיים עם משטח חומר פונקציונלי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח קו תא מסוגל לסנתז רמות גבוהות של ביוטין כאשר מושרה עם IPTG. הרמות הגבוהות של ביוטין יכולות לשמש כדי לשנות את פני השטח הפונקציונליים. הפרוטוקולים המפורטים כיצד להנדס …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים בתודה להכיר תמיכה בפרס FA9550-13-1-0108 מלשכת חיל האוויר של המחקר המדעי של ארה"ב. המחברים גם מכירים תמיכה מן הפרס N00014-15-1-2502 מן משרד המחקר של הצי של ארה"ב, מימון מהמכון לטכנולוגיה קריטית ומדע יישומי במכון הפוליטכני וירג'יניה סטייט, ומן מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע אחוות תוכנית, מספר הפרסים 1,607,310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
Riferimenti
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
