에 형광 단백질 융합의 시대<em> 칸디다</em> 종
Summary
PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.
Abstract
칸디다 종, 장 및 비뇨 생식기 책자의 유행 식민지 개척자는, 인간의 침습성 진균 감염의 대부분의 원인이다. 따라서, 분자 유전 도구들은 발병 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기 위해 필요하다. PCR 매개 유전자 변형은 검출을 용이하게하기 위해 에피토프 태그 된 단백질을 생성하는 간단하고 빠른 방법이다. 특히, 형광 단백질 (FP) 융합은 각각 형광 현미경 및 면역에 의해 모두 효모 세포와 단백질의 시각화 및 정량 분석을 할 수있는 강력한 도구입니다. 칸디다 종의 형질 전환을 용이하게 영양 마커 유전자와 함께 FP 인코딩 서열을 포함하는 플라스미드, 칸디다 FP의 구축 및 발현을 목적으로 생성되었다. 여기서, 우리는 칸디다 종의 FP 융합을 구성하기위한 전략을 제시한다. nourseothricin resista를 포함하는 플라스미드어느 녹색, 황색, 또는 체리 FPS (GFP, YFP, mCherry)는 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)의 유전자 – 특이 서열을 포함하는 프라이머와 함께 사용되는 FP 카세트를 생성하기위한 서열과 함께 NCE 변환 마커 유전자 (NAT1) . 이 유전자 특이 카세트를 상동 재조합을 통해 대응 유전자좌의 3'- 말단에 통합 할 수있는 능력을 갖는다. 관심의 유전자 유전자좌에 FP 서열의 성공적인 프레임 내 융합 현미경 및 / 또는 면역 검출 방법에 의한 융합 단백질의 발현을 분석 한 후, 유전자가 확인되어있다. 또한, 고도로 발현 된 단백질의 경우에 성공적인 융합체 형광 이미징 기술에 의해 주로 대해 스크리닝 할 수있다.
Introduction
칸디다 종은 모든 인간의 장 및 비뇨 생식기 책자를 식민지 공생 균이다. 그러한 즉 조산 또는 암 치료에서 면역 억제 효과 발생과 같은 면역 결핍의 조건에서, 칸디다 종은 기회 병원균이 될 수 있습니다. 칸디다 종, 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)가 가장 널리 진균 식민이며 침습성 진균 감염의 대부분을 야기한다. 이러한 C. 글라 브라, C.의 실로 시스, C.의 tropicalis 및 C와 같은 다른 칸디다 종, 일부 나타내는 고유 저항, 면역 저하 환자에서 심각한 감염을 일으킬 kruseii 일반적 따라서 이러한 플루코나졸과 암포 테리 신 B와 항진균 항생제를 사용하는 이 종의 일부와 감염은 특히 항 곰팡이 제와 예방 치료를 받고있는 환자에서 더 자주 관찰되고있다. 심지어 적절하고 적시에NTI 곰팡이 처리, 침략 칸디다 감염은 상당한 이환율과 사망률 1과 연관 될 것을 계속한다. 이 때문에 인체의 칸디다 종의 중요성, 그 병인 기전 연구 및 해명 있도록 쉽게 구할 분자 도구에 대한 요구가있다.
연구진은 시각화하고 미생물 세포와 그들이 표현하는 단백질을 정량화 할 수 있습니다 하나의 중요한 도구는 FP 융합 기술입니다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) – 매개 유전자 변형이 논문에 기재된 바와 같이, FP 서열 및 게놈 유전자좌 관심 서열을 코딩 칸디다 단백질 간의 융합의 구성을 허용한다. 구조물의 안정적 통합은 단백질 발현의 분석뿐만 아니라 단백질 현지화 역학을 용이하게한다. FP 서열을 함유하는 플라스미드는, 칸디다 알비 칸스의 발현을 최적화하고는 PCR 매개 g 사용될 수있다엔 변형 전략은 이전에 2, 3, 4, 5를 구성 하였다. C. 알비 칸스 및 C. 실로 시스 2, 3, 4, 5, 6, 7의 변환을 용이하게하는 영양 마커 유전자에 연결된 FP 서열 플라스미드 FP 변환 "카세트"을 포함한다. 현재 사용 가능한 플라스미드를 선택 영양 영양 요 구성 균주의 변환을위한 마커 유전자 (URA3, HIS1, ARG4)뿐만 아니라 auxotrophies이 결여 된 임상 균주의 변환을 용이하게하는 지배적 인 약물 내성 마커 (NAT1)의 다양한 포함되어 있습니다. 또한, 플라스미드 여보 쇼 최대 네 개의 다른 FP 시퀀스 (녹색 [GFP]에 대한 옵션을 포함[YFP] w, 시안 [CFP], 체리 [mCherry]) 및 카르복시 말단 단백질 융합의 건설, 또는 아미노 말단 단백질 융합의 건설을위한 프로모터 서열에 대한 ADH1 종결 서열 중 하나. 프라이머는 FP 카세트를 둘러싼 플라스미드 DNA에 동성으로 설계되었습니다. 또한, 프라이머는 상동 재조합 (그림 1)를 통해 게놈 궤적에 카세트의 통합을 용이하게 태그 할 관심있는 효모 유전자에 상 동성을 베어링 5'-확장 시퀀스가 포함되어 있습니다. 유전자 특이 FP 카세트를 PCR에 의해 생성 된 리튬 아세테이트로 처리하여 DNA의 흡수를위한 제작 능력 칸디다 세포로 형질 전환된다.
그림 1 : FP 시퀀스 융합은 칸디다 종에서 생성하는 방법의 다이어그램. (A) 플라스미드 DNA를 포함하여에스 FP 순서 및 저항 (NAT1) nourseothricin 시퀀스 인코딩. 앞으로 (FWD) 및 역방향 (REV) 프라이머의 상대 위치는 플라스미드 서열 상 동성의 영역을 나타내는 프라이머 및 유전자 고유 동성 영역 또는 프라이머 확장을 나타내는 보라색 부분의 검은 부분으로 표시됩니다. (B) FP 카세트는 칸디다로 변환 및 상동 재조합 (점선)를 통해 ENO1 게놈 궤적 내에 통합되어있다. ENO1의 말단에 FP 융합 시퀀스를 생성 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기서, 우리는 칸디다 단백질 융합 (Eno1-FP) 구조의 일례를 제시한다. 우리는 GFP, YFP를 코딩하는 서열과 함께 NAT1 변환 마커 유전자를 포함하는 플라스미드에 태그 또는 사용mCherry (그림 2). 이러한 플라스미드의 카르복시 말단에 융합 FPS Eno1 발현 결과 ENO1의 3'- 말단에 FPS의 융합을 촉진 유전자 특이 카세트를 생성하기 위해 PCR에서 프라이머와 함께 사용된다.
그림 2 : FP 카세트 함유 플라스미드의지도. 앞으로 (F) 및 플라스미드에서 카세트를 생성하는 데 사용 역 (R) 프라이머는 플라스미드에 자신의 동성의 상대 위치와 함께 표시됩니다. 표 1에 열거 된 프라이머 서열이다. F1과 R1은 또한 pYFP- NAT1 카세트를 생성 하였다. YFP- NAT1 카세트 (pMG2263)를 함유하는 플라스미드 GFP 서열 대신 YFP 제외한 pMG2120 동일하다. 카세트 크기 : GFP-NAT1, 3.7 KBP; mCherry- NAT1, 3.2 KBP; YFP- NAT1, 3.7 KBP. 이 그림은 Gerami-Nejad, 등에서 수정되었습니다. 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
에피토프의 구조는 상술 한 PCR 매개 유전자 변형 전략을 사용하는 칸디다 종의 서열은 세 단계로 요약 될 수있다 태그. 먼저, 카세트 모두 효모 게놈 내로 삽입 궤적 상동 통합 영역에 대해 원하는 서열을 코딩하는 PCR에 의해 이루어진다. 둘째로, 변환 될 수있는 효모 세포 리튬 아세테이트 카세트가 공동 인큐베이션 화학적 능력 만들어진다. 셋째, 세포 형질 전환 체를 복구하는 선택 배지 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원래 mCherry FP 순서를 제공 N. 딘 감사, M. Gerami-Nejad 플라스미드의 건설이 프로젝트의 개발 기간 동안 도움이되는 조언을 기술 지원 B. 라슨, 그리고 T. Heisel. JB는 유럽 연구위원회 고급 상 340087 (RAPLODAPT)에 의해 지원되었다. 현미경 및 이미징 시스템은 미네소타 소아 과학 재단의 대학과 미네소타 이미징 센터의 대학에 의해 제공되었다.
Materials
| 100W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5ml, 1.5ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C ) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C ) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4°C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
Riferimenti
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