Produção de fusões de proteína fluorescente em<em> Candida</em> Espécies

Summary

Modificação do gene mediada por PCR pode ser usado para gerar fusões de proteínas fluorescentes em espécies de Candida, o que facilita a visualização e quantificação das células de levedura e proteínas. Aqui, nós apresentamos uma estratégia para a construção de uma fusão proteína fluorescente (ENO1-FP) em Candida parapsilosis.

Abstract

Espécies de Candida, colonizadores prevalentes das vias intestinais e genito-urinário, são a causa da maioria das infecções fúngicas invasivas em humanos. Assim, ferramentas moleculares e genéticos são necessários para facilitar o estudo de seus mecanismos de patogénese. modificação do gene mediada por PCR é uma abordagem simples e rápida para gerar proteínas marcadas no epitopo para facilitar a sua detecção. Em particular, a proteína fluorescente (FP) fusões são ferramentas poderosas que permitem a visualização e quantificação de ambas as células de levedura e proteínas por microscopia de fluorescência e imunotransferência, respectivamente. Os plasmídeos contendo as sequências de codificação de FP, juntamente com genes marcadores nutricionais que facilitam a transformação de espécies de Cândida, foram geradas com a finalidade de construção e expressão em FP Candida. Aqui, nós apresentamos uma estratégia para a construção de uma fusão FP em uma espécie de Candida. Os plasmídeos contendo o trabalho a prova nourseothricingene transformação marcador NCE (NAT1), juntamente com sequências, quer para verde, amarelo, ou cereja PQ (GFP, YFP, mCherry) são utilizados juntamente com iniciadores que incluem sequências específicas de gene numa reacção em cadeia da polimerase (PCR) para gerar uma cassete de FP . Esta cassete de gene-específico tem a capacidade de se integrar na extremidade 3 'do locus do gene correspondente através de recombinação homóloga. Bem sucedida de fusão em-quadro da sequência de FP no locus do gene de interesse é verificada geneticamente, seguido por análise de expressão de proteína de fusão por microscopia e / ou métodos de detecção de imuno. Além disso, para o caso de proteínas altamente expressas, fusões bem sucedidas pode ser rastreada para principalmente por técnicas de imagem por fluorescência.

Introduction

Espécies de Candida são fungos comensais que colonizam as vias intestinais e genito-urinário de todos os seres humanos. Sob condições de imunodeficiência, tal como o que ocorre com o nascimento prematuro ou efeitos imunossupressores de tratamentos para o cancro, espécies de Cândida pode tornar-se agentes patogénicos oportunistas. Das espécies de Candida, Candida albicans é o colonizador fúngica mais prevalente e faz com que a maioria das infecções fúngicas invasivas. Outras espécies de Candida, como C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. kruseii também causar infecções graves em pacientes imunocomprometidos, com algumas apresentando resistência intrínseca aos comumente utilizados antibióticos anti-fúngicas, como fluconazol e anfotericina B. Assim, infecções com algumas destas espécies estão sendo observados com maior frequência, especialmente em pacientes que estão sendo tratados profilaticamente com agentes anti-fúngicos. Mesmo com uma adequada e atempadatratamento nti-fúngica, infecções por Candida invasivos continuem a ser associado com ^uma morbidade e mortalidade significativas. Devido à importância de espécies de Candida em saúde humana, existe uma necessidade para ferramentas moleculares prontamente disponíveis que permitem o estudo e a elucidação dos seus mecanismos de patogénese.

Uma importante ferramenta que permite que os pesquisadores para visualizar e quantificar células microbianas e as proteínas que eles expressam é a tecnologia de fusão FP. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) do gene mediada por modificação, tal como descrito no presente documento, permite a construção de fusões, entre as sequências de FP e uma proteína Candida sequência codificante de interesse no seu locus genómico. A integração estável da construção facilita a análise da expressão da proteína, bem como dinâmica localização de proteínas. Os plasmídeos contendo as sequências de PF, optimizado para a expressão em Cândida albicans e que pode ser utilizado no g mediada por PCRestratégia de modificação eno, foram previamente construídas ^{2, 3, 4, 5.} Os plasmídeos contêm FP transformação de "cassetes": uma sequência de FP ligado a um gene marcador nutricional que facilita a transformação de C. albicans e C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7.} Actualmente plasmídeos disponíveis contêm uma variedade de genes de selecção marcadores nutricionais (URA3, His1, ARG4) para a transformação de estirpes auxotróf iças, bem como um marcador de resistência a droga dominante (NAT1), o que facilita a transformação de estirpes clínicas falta auxotrophies. Além disso, os plasmídeos contêm opções para até quatro sequências FP diferentes (verde [GFP], yelloW [YFP], ciano [PCP], e cereja [mCherry]) e, ou uma sequência de terminação de ADH1 para construção de fusões de proteína carboxi-terminal, ou uma sequência promotora para a construção de proteínas de fusão do terminal amino. Os iniciadores foram concebidos com homologia com o ADN de plasmídeo em torno da cassete de FP. Além disso, os iniciadores contêm também sequências 5'-extensão portadoras de homologia para o gene de levedura de interesse a ser marcado, o que facilita a integração da cassete no locus genómico através de recombinação homóloga (Figura 1). Cassetes de genes específicos de FP são gerados por PCR e, em seguida, transformados em células de Candida tornadas competentes para a absorção de ADN por meio do tratamento com acetato de lítio.

Figura 1: Diagrama de como fusões de sequências de FP são geradas em espécies de Candida. (A) inclu O DNA de plasmídeoes uma sequência FP e uma sequência que codifica nourseothricin resistência (NAT1). localizações relativas da frente (FWD) e inverso (REV) iniciadores são mostrados, com porções pretas dos iniciadores que indicam a região de homologia com a sequência de plasmídeo e as porções roxo que denotam a região de homologia específico para o gene ou a extensão do iniciador. Cassetes (B) FP são transformados em Candida e integrar dentro do locus genómico ENO1 através de recombinação homóloga (linhas pontilhadas). (C) resultante sequência de fusão de FP na extremidade 3 'de ENO1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, apresentamos um exemplo de proteína de fusão (ENO1-FP) construções em espécies de Candida. Nós utilizam a marcação de plasmídeos contendo o gene NAT1 transformação marcador juntamente com as sequências que codificam GFP, YFP, oumCherry (Figura 2). Estes plasmídeos são usados juntamente com iniciadores de PCR para gerar cassetes de gene-específicos que facilitam a fusão de PQ para a extremidade 3 'de ENO1, resultando em expressão de ENO1 fundido com PQ no seu terminal carboxi.

Figura 2: Mapas de FP plasmídeos contendo cassetes. Para a frente (F) e inverso (R) iniciadores utilizados para gerar as cassetes dos plasmídeos estão indicados juntamente com a localização relativa da sua homologia com os plasmídeos. As sequências dos iniciadores são como listados na Tabela 1. F1 e R1 também foram utilizadas para gerar a cassete pYFP- NAT1. O plasmídeo contendo a cassete de YFP- NAT1 (pMG2263) é idêntico ao pMG2120 com excepção da YFP no lugar da sequência de GFP. Formatos de cassete: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kpb; YFP- NAT1, 3.7 kpb. Este valor foi modificado a partir Gerami-Nejad, et al. ⁴ Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Modelo Isolar os plasmídeos a partir de E. coli Crescer E. coli contendo o plasmídeo molde durante a noite em 10 ml de caldo de lisogenia (LB) com 200 mg / L de ampicilina (AMP), a 37 ° C com agitação. Células colheita por centrifugação a 6000 xg durante 2 min. Decantar líquido, isolar e purificar DNA a partir de células de E. coli por um método padrão tal como previamente descrito em Ausubel et al. 8. ADN…

Representative Results

Como um exemplo, utilizou-se o protocolo descrito acima para GFP e mCherry fusões de ENO1 numa estirpe de laboratório C. parapsilosis. Cada transformante putativo foi inicialmente novamente riscados para o crescimento. Neste exemplo, uma vez que a proteína de fusão resultante é altamente expresso (enolase) e PQ são brilhantes, fomos capazes de rastrear os transformantes por microscopia de fluorescência, antes de realizar PCR de diagnóstico (Figura 3) <su…

Discussion

Construção de sequências de epitopo etiquetado em espécies de Candida, utilizando a estratégia de modificação de genes mediada por PCR acima descrito pode ser resumido como um processo em três etapas. Em primeiro lugar, a cassete é feita por PCR que codifica a sequência desejada, tanto por integração e regiões homólogas para o locus da inserção no genoma da levedura. Em segundo lugar, as células de levedura a ser transformadas são feitas quimicamente competente com acetato de lítio e co-incub…

Materials

100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA