Guiado por ecografía intracardiaca inyección de células madre mesenquimales humanas para aumentar autoguiado hacia el blanco en el intestino para su uso en modelos murinos de enfermedades de intestino inflamatorias experimentales
Summary
Estudios murinos en modelos de inflamación colónica han demostrado que un pequeño porcentaje (1-5%) de las células madre mesenquimales (MSC) inyectado por vía intravenosa o por vía intraperitoneal en casa a los inflamación colon1,2. Este estudio demuestra que las inyecciones intracardiacas guiada por ultrasonido de MSCs como resultado mayor localización en el intestino.
Abstract
Enfermedad de Crohn (EC) es una enfermedad inflamatoria crónica común de la pequeño e intestinos grandes. Murinas y humanas las células madre mesenquimales (MSCs) tienen potencial inmunosupresor y han demostrado para suprimir la inflamación en modelos de ratón de la inflamación intestinal, aunque la vía de administración puede limitar su homing y efectividad 1 , 3 , 4 , 5. aplicación local de MSCs en modelos de lesión colónica ha demostrado mayor eficacia en el mejoramiento de la inflamación en el colon. Sin embargo, hay escasez de datos sobre técnicas para mejorar la localización de MSCs médula ósea humanas (hMSCs) al intestino, el sitio de la inflamación en el modelo de SAMP-1/YitFc (SAMP) enfermedad de Crohn experimental. Este trabajo describe una técnica novedosa para la inyección intracardiaca guiada por ultrasonido de hMSCs en ratones de la SAMP, un modelo bien caracterizado espontáneo de la inflamación intestinal crónica. Como controles se utilizaron ratones AKR/J (AKR) libre de inflamación emparejado de sexo y edad. Para analizar la biodistribución y la localización, hMSCs fueron transduced con un lentivirus que contiene un reportero triple. El reportero triple consistió en luciferasa de luciérnaga (fl), para obtener imágenes bioluminiscentes; monomérica proteína fluorescente roja (mrfp), para la clasificación de la célula; y truncada del simplex del herpes virus timidina kinasa (ttk), para la proyección de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET). Los resultados de este estudio muestran 24 h después de la administración intracardiaca, hMSCs localizar en el intestino de los ratones de la SAMP en comparación con ratones AKR libre de inflamación. Esta novela, inyección guiada por ultrasonido de hMSCs en el ventrículo izquierdo de los ratones SAMP asegura una alta tasa de éxito de la entrega de la célula, permitiendo la recuperación rápida de los ratones con mínima morbilidad y mortalidad. Esta técnica podría ser un método útil para la localización mejorada de MSCs en otros modelos de inflamación intestinal pequeño, como TNFΔRE6. Futuros estudios determinarán si la mayor localización de hMSCs por entrega intrarterial puede llevar a mayor eficacia terapéutica.
Introduction
Enfermedad de Crohn (EC) es una enfermedad inflamatoria crónica común de la pequeño e intestinos grandes y se piensa para resultar de una respuesta inadecuada del sistema inmunológico a microbios intestinales7,8. Estudios recientes han demostrado que tanto murinas como humanas las células madre mesenquimales (MSCs) puede suprimir la inflamación en modelos de ratón de inflamación intestinal1,3,4,5. Hay múltiples ensayos clínicos en curso que utilizan MSCs humanas derivadas de médula ósea o tejido adiposo para tratar a pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye CD9. En estos ensayos clínicos se han utilizado dos rutas para la terapia del MSC: uno consiste en la infusión sistémica (es decir, por vía intravenosa) de MSCs para EII luminal (incluye CD) y el otro consiste en la aplicación localizada, inyección de células madre en la fístula tracto de los pacientes con EC perianal. En un reciente metanálisis de la terapia MSC para las EII, sistémica (es decir, intravenosa) terapia MSC para las EII luminal (incluye CD) era eficaz en hasta un 40% (IC del 95%: 7-79%) de los pacientes, mientras que la eficacia era mucho mayor, en el 61% (IC del 95%: 36-85%), cuando las MSCs se inyecta localmente en el enfermo CD fístula9. Un multicentro de reciente fase III controlados con placebo aleatorizado de alogénico las células madre adiposas inyectado directamente en la fístula perianal de CD pacientes demostrada estadísticamente significativa evidencia clínica y radiológica de curación, las fístulas perianales corroborando los hallazgos de los meta-análisis10. Se ha investigado adecuadamente las razones de la baja eficacia del MSC tratamiento administrado por vía intravenosa para CD luminal, pero una de las razones puede ser el inadecuada autoguiado hacia el blanco de MSCs en el sitio de la inflamación. Estudios murinos en modelos de inflamación colónica han demostrado que sólo un pequeño porcentaje de MSCs (1-5%) inyectados por vía intravenosa alcanza el colon inflamado; el restantes MSCs son filtrados por los pulmones (efecto de primer paso)1,2 ,5,11,12. Múltiples estudios murine por lo tanto, han utilizado la vía intraperitoneal (i.p.) para la administración de MSC en modelos animales con colitis4. Sin embargo, también han demostrado que sólo una pequeña fracción de las células alcanzar engraft el colon y que la eficacia está relacionado con la secreción de factores solubles paracrinos, como factor de necrosis tumoral-inducible gene 6 proteína (TSG-6)2. El mecanismo MSC de la inmunosupresión y la curación implica un enfoque múltiple que implica paracrina; factores de proximidad-independiente de la célula, como TSG-6; y factores dependientes de la proximidad, la célula como programados ligando de muerte 1 (PD-L1); o irregular 1. Por lo tanto, la localización de MSC en el sitio de la inflamación puede resultar en mayor eficacia9,13. De hecho, un estudio reciente mostró que MSCs implantados directamente en el sitio de la lesión colónica resultaron en curación secretando promover angiogénesis factor crecimiento endotelial vascular (VEGF). Por otro lado, se observó un mínimo efecto curativo después de inyección intravenosa5. Para aumentar su localización en el sitio de la inflamación (es decir, el intestino en ratones SAMP), se desarrolló esta técnica de inyección intracardiaca guiada por ultrasonido para la administración de MSC en el ventrículo izquierdo. Inyección guiada por la imagen asegura una inyección exacta, que conduce a una mayor tasa de éxito y a la disminución de morbilidad y mortalidad. Por otra parte, la inyección de MSCs en el ventrículo izquierdo entrega a circulación arterial, que puede llegar al intestino inflamado antes de ser atrapado en los pulmones.
En este estudio, MSCs de médula ósea humanas (hMSCs) fueron utilizados para la inyección en el modelo murino de SAMP-1/YitFc (SAMP) de CD14. SAMP es un bien caracterizado espontáneo modelo murino de inflamación crónica que se desarrolla la inflamación intestinal pequeño con casi 100% de penetrancia14. La inflamación se desarrolla en respuesta a la microflora en la ausencia de cualquier manipulación de químico, inmunológico o genético y parece humano CD11. Pareados por sexo y edad libre de inflamación AKR/J (AKR) ratones, los ratones de control parental de SAMP, se utilizaron en este estudio.
El hMSCs fueron aislados y ampliados en el laboratorio de muestras de médula ósea (MO) de donantes normales, desconocidos después de uso de consentimiento informado validado y publicado previamente protocolos15,16. Después del aislamiento y expansión, la capacidad MSC adipogenic osteogénica, en, y la diferenciación condrogénica fue evaluada en el laboratorio por varios ensayos15. El análisis funcional osteogénico realizó implantación de cubos de cerámica de hidroxiapatita/tricálcico matriz de fosfato que contienen hMSCs por vía subcutánea en immunocompromised ratones de SCID CB17-Prkdc17. El ensayo de cubo demuestra la osteogénesis y condrogénesis potenciales y se considera la prueba definitiva para evaluar cada MSC preparados17. Para visualizar hMSCs en vivo después de la inyección, lentivirus se utilizó para transducir hMSCs con construcción de gene triple reportero de luciferasa de luciérnaga (fl), monomérica proteína fluorescente roja (mRFP) y herpes simplex virus timidina kinasa (ttk ), impulsado por una modificada myeloproliferative sarcoma virus (mnd) promotor18. La luciferasa de la luciérnaga en el reportero triple es enzima eso luciferin inyectado coberteras a oxyluciferin de hMSCs y produce fotones blanco luz. Esto es detectado por la cámara sensible dispositivo de carga acoplada (CCD) (bioluminiscencia) en un en vivo óptica de sistema, que permite la visualización de hMSCs vivo en ratones. Bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen es una técnica sensible que puede usarse en serie para el seguimiento de las células y para el análisis ex vivo . El uso de un promotor fuerte EMN impulsa la expresión continua de la triple fusión reportero gene construcción y permite la proyección de imagen de hMSCs inyectado por más de 16 semanas19. El hMSCs son difíciles de transducir y tienen una eficacia de transducción de señales bajas. Usando un protocolo optimizado, mejoró la eficiencia de la transducción de hMSCs y la expresión del transgén era mayor de18. Con expresión de mRFP (uno de los genes del reportero triple) en citometría de flujo, se demostró la capacidad de transducir hMSCs con una alta eficiencia de hasta un 83%. Ensayos de diferenciación y en vivo cubo ensayos demostraron la capacidad de hMSCs transduced diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio describe una nueva técnica para la inyección intracardiaca de hMSCs en un modelo de ratón pequeño-intestinal de CD experimental guiada por ultrasonido. Esta técnica tiene alta tasa de supervivencia y éxito, como la trayectoria de la aguja puede ser ajustada en base a imágenes en tiempo real de alta resolución del ventrículo izquierdo de ratón, proporcionados por la ecografía. La ventaja de la entrega para el ventrículo izquierdo es que hMSCs después son distribuidos intra arterial y bypass de ci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave es apoyado por el Departamento de defensa grant PR141774 y la de Crohn y Colitis de América carrera desarrollo Premio de la Fundación. El laboratorio de Fabio Cominelli es apoyado por los NIH concede DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) y DK07948 (F.C.). El laboratorio de Arnold Caplan es apoyado en parte por la Fundación de Baldwin de Virginia E. y L. David. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el estudio de análisis o la escritura del manuscrito. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
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