Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental
Summary
Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que uma pequena porcentagem (1-5%) de células-tronco mesenquimais (MSC) injetada por via intravenosa ou intraperitonealmente home ao cólon inflamado1,2. Este estudo mostra que guiada por ultra-som intracardíacos injeções de MSCs resultam em aumentada localização até o intestino.
Abstract
A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e o intestino. Murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) têm potencial imunossupressor e foram mostradas para suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal, mesmo que a via de administração pode limitar sua homing e eficácia 1 , 3 , 4 , 5. aplicação local de MSCs para modelos de lesão do cólon tem demonstrado maior eficácia em atenuar a inflamação no cólon. No entanto, há escassez de dados sobre técnicas para melhorar a localização do MSCs de derivados da medula óssea humanas (hMSCs) para o intestino delgado, o local da inflamação no modelo da doença de Crohn experimental SAMP-1/YitFc (SAMP). Este trabalho descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em camundongos SAMP, um modelo bem caracterizado espontâneo de inflamação intestinal crônica. Sexo e idade-correspondência, livre de inflamação AKR/J (AKR) os ratos foram usados como controles. Para analisar a biodistribuição e a localização, hMSCs foram transfectadas com um lentivirus contendo um repórter triplo. O repórter triplo consistia de luciferase de vaga-lume (fl), para a imagem latente bioluminescente; proteína monomérica vermelha fluorescente (mrfp), para a classificação de célula; e truncado herpes simplex vírus timidina quinase (ttk), para tratamento de imagens de tomografia por emissão de pósitrons (PET). Os resultados deste estudo mostram que 24 h após a administração intracardíaca, hMSCs localizar-se no intestino delgado de ratos SAMP ao invés de ratos AKR livre de inflamação. Neste romance, guiada por ultra-som de injeção de hMSCs no ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma elevada taxa de sucesso de entrega de celular, permitindo a recuperação rápida de ratos com mínima morbidade e mortalidade. Esta técnica pode ser um método útil para a localização avançada do MSCs em outros modelos de inflamação intestinal-pequeno, como TNFΔRE6. Estudos futuros determinará se a localização de aumentada do hMSCs pela entrega intra-arterial pode levar à maior eficácia terapêutica.
Introduction
A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e intestino e é pensada para resultar de uma resposta inadequada do sistema imunológico do host para micróbios intestinais7,8. Estudos recentes têm mostrado que murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) podem suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal1,3,4,5. Existem vários ensaios clínicos em curso que usam MSCs humanas derivadas da medula óssea ou tecido adiposo para tratar pacientes com doença inflamatória intestinal (IBD), que inclui CD9. Duas rotas para a terapia MSC têm sido utilizadas nestes ensaios clínicos: uma envolve a infusão sistêmica (ou seja, por via intravenosa) de MSCs para IBD luminal (incluindo CD) e o outro envolve a aplicação/injeção localizada de células-tronco na fístula trato de pacientes com CD perianal. Em uma recente meta-análise da terapia MSC para IBD, sistêmica (ou seja, por via venosa) terapia MSC para IBD luminal (incluindo CD) foi eficaz em até 40% (95% CI: 7-79%) dos pacientes, Considerando que a eficácia era muito maior, em 61% (95% CI: 36-85%), quando os MSCs foram injetados localmente os doentes de fístula CD9. Um multicêntrico III fase recente randomizado placebo controlado de células-tronco adiposas alogênico injetado diretamente a fístula perianal de CD pacientes mostrou estatisticamente significativa evidência clínica e radiológica de fístula perianal, cura, corroborando os achados da meta-análise10. As razões para a baixa eficácia da terapia MSC administrada por via intravenosa para CD luminal foi investigado inadequadamente, mas uma razão pode ser a orientação inadequada do MSCs para o local da inflamação. Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que apenas uma pequena percentagem de MSCs (1-5%) injetada por via intravenosa alcançar o cólon inflamado; os MSCs restantes são filtrados pelos pulmões (efeito de primeira passagem)1,2 ,5,11,12. Vários estudos murino, portanto, tem usado a via intraperitoneal (i.p.) para administração de MSC em modelos animais de colite4. No entanto, eles também têm demonstrado que somente uma pequena fração das células alcançar e engraft do cólon e que a eficácia é relacionado com a secreção de fatores solúveis parácrina, como a proteína do gene fator de necrose tumoral-inducible 6 (TSG-6)2. O mecanismo MSC de imunossupressão e cura envolve uma abordagem de várias frentes que envolve parácrina; fatores de proximidade-independente de célula, como TSG-6; e celular fatores dependentes de proximidade, como programado morte-ligante 1 (PD-L1); ou 1 irregulares. Portanto, localização de MSC para o site da inflamação pode resultar em maior eficácia9,13. De fato, um estudo recente mostrou que MSCs implantados diretamente no local da lesão do cólon resultaram na cura através da secreção de promover a angiogênese vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Por outro lado, observou-se um efeito de cura mínimo após injeção intravenosa5. Para aumentar a sua localização para o site da inflamação (ou seja, o intestino delgado em ratos SAMP), foi desenvolvida esta técnica de Injeção intracardíaca guiada por ultra-som para administração de MSC no ventrículo esquerdo. Guiada por imagem injeção garante uma injeção exata, o que leva a uma maior taxa de sucesso e a diminuição da morbidade e mortalidade. Além disso, a injeção de MSCs no ventrículo esquerdo distribui-las para circulação arterial, onde eles podem alcançar o intestino inflamado antes de tornar-se preso nos pulmões.
Neste estudo, MSCs derivadas da medula óssea humanas (hMSCs) foram usados para injeção no modelo murino de CD14SAMP-1/YitFc (SAMP). Totem é um modelo murino espontâneo bem caracterizado de inflamação crônica que se desenvolve a inflamação intestinal-pequeno com cerca de 100% de penetrância14. A inflamação se desenvolve em resposta a microflora na ausência de qualquer manipulação genética, química ou imunológica e muito semelhante à humana CD11. Sexo e idade-correspondente livre de inflamação AKR/J (AKR) ratos, os ratos de controlo parental da SAMP, foram utilizados neste estudo.
Os hMSCs foram isoladas e expandidas em laboratório de amostras de medula óssea (BM) obtidos de doadores normais, não identificados, após consentimento informado usando validado e publicado anteriormente protocolos15,16. Após isolamento e expansão, a capacidade MSC em osteogênica, adipogenic, e chondrogenic diferenciação foi avaliada em laboratório por vários ensaios15. Realizou-se o ensaio funcional osteogênico implantando cubos de cerâmicos da matriz de fosfato tricálcico/hidroxiapatita contendo hMSCs por via subcutânea em imunocomprometidos de ratos SCID CB17-Prkdc17. O ensaio de cubo demonstra a osteogênese e condrogênese potencial e é considerado o último teste de avaliação individual de preparações de MSC17. Para visualizar hMSCs na vivo após a injeção, lentivirus foi usado para transduce hMSCs com construção de gene repórter triplo que consiste de luciferase de vaga-lume (fl), proteína monomérica fluorescente vermelha (mRFP) e herpes simplex vírus timidina quinase (ttk ), impulsionado por um vírus (mnd) de sarcoma mieloproliferativa modificados promotor18. A luciferase de vaga-lume no repórter triplo é uma enzima que luciferina injetado coverts para oxyluciferin em hMSCs e produz fótons/luz branca. Isso é detectado pela câmera sensível dispositivo de carga acoplada (CCD) (bioluminescência) em um na vivo óptico de imagem de sistema, que permite a visualização de hMSCs ao vivo em ratos. Bioluminescência imaging (BLI) é uma técnica sensível que pode ser usada em série para controlar as células e para análise ex vivo . O uso de um promotor forte mnd conduz a expressão contínua da construção de gene de fusão tripla repórter e permite a imagem latente de hMSCs injetado por mais de 16 semanas19. Os hMSCs são difíceis de transduce e ter um rendimento baixo transdução. Usando um protocolo otimizado, a eficiência de transdução de hMSCs foi melhorada e a expressão do transgene foi reforçada18. Usando a expressão de mRFP (um dos genes repórter triplo) na citometria de fluxo, demonstrou-se a capacidade de transduce hMSCs com uma alta eficiência de até 83%. Ensaios de diferenciação e na vivo o cubo ensaios demonstraram a capacidade do transduzidas hMSCs de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em um modelo do CD experimental rato pequeno-intestinal. Esta técnica tem muito alta taxa de sobrevivência e de sucesso, como a trajetória da agulha pode ser ajustada com base em imagens de alta resolução, em tempo real do ventrículo esquerdo do mouse, fornecida pelo ultra-som. A vantagem da entrega para o ventrículo esquerdo é que hMSCs são então distribuídos intra arterially e ignorar a circulação venosa, e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maneesh Dave é suportado pelo departamento de defesa grant PR141774 e o Crohn e a colite Foundation of America carreira desenvolvimento Award. O laboratório de Fabio Cominelli é suportado pelo NIH concede DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (F.C.) e DK07948 (FC). O laboratório de Arnold Caplan é suportado em parte pela David L. e E. Virginia Baldwin Foundation. Agências de fomento não tinham qualquer papel no estudo de análise ou escrita do manuscrito. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores.
Materials
| DMEM-LG | Gibco | 31600-091 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25-200-072 | |
| Proteamine Sulfate | Sigma Aldrich | P4020-1G | |
| D-Luciferin | Goldbio | luck-500 | |
| Fetal Bobine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 175 cm tissue cutlure flasks | Corning | 431080 | |
| 75 cm tissue cutlure flasks | Corning | 430720 | |
| Centrifuge tubes | Crysalgen | 23-2265 | |
| Tissue-Plus O.C.T. compound | Fisher HealthCare | 4585 | |
| Cryomold Standard | Tissue-Tek | 4557 | |
| Lenti-Pac HIV Expression Packaging System | GeneCopoeia | HPK-LvTR-20 | |
| Povidone Ionidine swabs | Medline | MDS093901 | |
| Hair removal cream | Nair | N/A | |
| Isoflurane | Piramal Helathcare | NDC 66794 013 25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Aquasonic 100 ultrasound transmission gel | Parker laboratories | 01 08 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SAMP mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| AKR mice | Cleveland Digestive Disease Research Core Centre | ||
| Vevo 770 imaging system | Visual Sonics, Toronto, Canada | ||
| IVIS spectrum series system | PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Living image software | CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA | ||
| Triple reporter | Kindly provided by Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citation 19) | ||
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