Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función
Summary
Un método simple y efectivo que emplea nanopartículas magnéticas para detectar y enriquecer células B reactivas al antígeno para el análisis funcional y fenotípica se describe.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Dilución limitante análisis de la frecuencia de precursor de células secretora de anticuerpos han sugerido que las células B reactivas a un antígeno particular se producen normalmente a una frecuencia de 0,05 a 0,005% en el repertorio normal de, dependiendo del estado de la vacunación y el tamaño / número de epítopos presentes en el antígeno. La baja frecuencia de estas células ha hecho que sea difícil para el estudio de los cambios en su estado durante el desarrollo de la respuesta inmune, tales como después de la vacunación o la exposición a un antígeno extraño, o durante el desarrollo de la autoinmunidad. Anteriormente, los investigadores han llevado a cabo el aislamiento de células B reactivas al antígeno utilizando técnicas que van desde las placas recubiertas con antígeno o adsorbentes de la columna, para la reposición de glóbulos rojos antígeno recubierto, a clasificación de células 1, 2, 3, 4, 5, 6 activada por fluorescencia. though estas técnicas han tenido éxito en la identificación y el aislamiento de células B reactivas al antígeno, los resultados han variado en términos de rendimiento, pureza y capacidad de ampliación. Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para detectar y enriquecer tanto subpoblaciones de linfocitos B raras usando nanopartículas magnéticas. El método permite el enriquecimiento con rendimiento relativamente alto y la pureza de las poblaciones de partida de gran tamaño, y es compatible con el análisis de las respuestas a antígeno. Al enriquecer a partir de poblaciones de células en suspensión, el método elimina las limitaciones que se asocian con la geometría de placas o columnas recubiertas de antígeno, y límite de rendimiento. Finalmente, ya que las células enriquecidas permanecen asociados con el antígeno y un reportero fluorescente, que se pueden purificar aún más por FACS clasificación. Como se describe en el presente documento hemos usado este enfoque para el estudio de las células de toxoide del tétanos reactiva de sangre periférica B antes y después de la inmunización de sujetos humanos, así como las células B autoantígeno reactiva de sujetos con diferentes autoitrastornos mmune, incluyendo la diabetes tipo 1, enfermedad de Graves, y la enfermedad de Hashimoto 7. El método funciona igual de bien en el ratón y humano, y es compatible con el análisis de las células B reactivas al antígeno de una variedad de tejidos (manuscrito en preparación).
En su formato básico, las células mononucleares de sangre periférica se incubaron primero con el antígeno biotinilado junto con anticuerpos para antígenos de la superficie celular necesarias para el análisis fenotípico. Esta etapa de marcaje es seguido por el lavado y fijación, y la adición de estreptavidina acoplada a colorante rojo lejano fluorescente para la detección de las células de unión biotinilado-antígeno (Figura 1). Estudios previos han identificado las células B específicas de antígeno de una manera similar pero utilizando antígenos directamente conjugado con un fluorocromo 8, 9, 10, 11. Aunque este es un dignoenfoque, el uso de antígenos biotinilados en conjunción con estreptavidina permite una mayor amplificación de la señal (por lo tanto una mejor diferenciación de la unión y las células no vinculante), en particular cuando los antígenos son pequeñas 12, 13, 14. Una consideración adicional es el uso de estreptavidina en lugar de avidina porque estreptavidina se desglicosilada, la disminución de la unión no específica. Además, usamos colorante rojo lejano fluorescente como el fluorocromo debido a su fotoestabilidad, rendimiento cuántico (brillo), y su pequeño tamaño (~ 1,3 kD). Fluorocromos de proteínas como la ficoeritrina (~ 250 kD) y aloficocianina (~ 105 kDa) 15 no son óptimas, ya que potencialmente contienen muchos epítopos antigénicos. El uso de un pequeño tinte fluorescente orgánica compuesta de un único epítopo, tal como tinte rojo lejano fluorescente, reduce la complejidad de la población de células aislada.
Una vez que son células con biotina-antigen y adsorbido rojo lejano-colorante fluorescente-estreptavidina, que se enriquecen usando nanopartículas magnéticas de tinte-conjugado anti-rojo lejano fluorescentes. Nanopartículas individuales no son detectados por la mayoría de los citómetros de flujo y por lo tanto no tienen que ser retirados antes de la purificación por clasificación FACS y ensayos de aguas abajo 16. la selección magnética de células B específicas de antígeno enriquece la población de interés, lo que elimina el tiempo y el coste de clasificar los eventos raros utilizando un citómetro de flujo.
A continuación les mostramos los resultados representativos de enriquecimiento de células B-toxoide tetánico-específica de un sujeto antes y siete días después de la inmunización de refuerzo de toxoide tetánico. Elegimos esta aplicación particular como un ejemplo con el fin de demostrar la capacidad de este método para enriquecer células B específicas de antígeno siguientes aguda en la estimulación in vivo. Cuando se combina con citometría de flujo, este método es capaz de enriquecer y diferenciar específica de antígeno ingenuo, la memoria, ycélulas y plasmablasto B permite al investigador para seguir los cambios en su frecuencia con el tiempo. Además, se incluye otra posible ensayo de aguas abajo, por ejemplo, un ensayo ELISPOT, lo que demuestra que las células conservan la capacidad de secretar anticuerpos después de enriquecimiento. Otra aplicación de este método podría implicar la transferencia adoptiva de células enriquecidas en un huésped. Hemos demostrado anteriormente células mantienen la capacidad para actuar como células presentadoras de antígeno a las células T específicas de antígeno después del aislamiento y de transferencia (datos no mostrados). Por lo tanto, hay una serie de posibles ensayos de aguas abajo que pueden ser acoplados con el método, que en conjunto informa a la comprensión de la respuesta inmune específica de antígeno. Hemos descrito a continuación el método, incluidos los controles para determinar el rendimiento general, la pureza, la especificidad de la célula, y doblar-enriquecimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un nuevo método para llevar a cabo el aislamiento y enriquecimiento de células B de unión a antígeno de la sangre periférica humana. El método es fácilmente aplicable a los ratones y a otros tejidos, tales como el bazo y los ganglios, y es compatible con el análisis post-enriquecimiento de fenotipo y la función celular (manuscrito en preparación).
El usuario debe tener en cuenta una serie de variables que pueden afectar el éxito de este procedimiento. Por experie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
Riferimenti
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