O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares
Summary
Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.
Abstract
Biosensores estão se tornando cada vez mais importante e implementadas em várias áreas tais como detecção de agentes patogénicos, diagnóstico molecular, monitoramento ambiental e controle de segurança de alimentos. Neste contexto, usamos β-lactamases como enzimas repórter eficiente em vários estudos de interação da proteína-proteína. Além disso, sua capacidade de aceitar inserções de peptídeos ou proteínas/domínios estruturados fortemente incentiva o uso destas enzimas para gerar proteínas quiméricas. Em um estudo recente, inserimos um fragmento de anticorpo de domínio único para o β-lactamases de Bacillus licheniformis BlaP. Estes domínios pequenos, também chamados de nanobodies, são definidos como domínios de ligação de antígeno de anticorpos de cadeia única de camelídeos. Como comum anticorpos de cadeia dupla, eles mostram afinidades altas e especificidades para seus alvos. Proteínas quiméricas resultantes exibiram uma afinidade elevada contra seu destino mantendo a atividade de β-lactamase. Isto sugere que as partes nanobody e β-lactamases permanecem funcionais. No presente trabalho, relatamos um protocolo detalhado que combina o nosso sistema de β-lactamases de híbrido para a tecnologia biosensor. A vinculação específica da nanobody ao seu alvo pode ser detectada graças a uma medição titulometria dos prótons liberados pela atividade catalítica da enzima.
Introduction
Biosensores são dispositivos analíticos que combinam uma interação bio-molecular com dispositivos de sinalização físicos ou químicos conhecido como transdutores1. Os sinais gravados podem ser interpretados e convertidos para monitorar as interações entre os parceiros de imobilizado e livre. A maioria dos biosensores envolve o uso de um anticorpo para detectar analitos tais como hormonas ou patógeno diferentes marcadores2. Sensor de diferentes formatos podem ser usados e incluem biosensores baseados em massa, magnéticos, ópticos ou eletroquímicos. O último está entre os mais comumente usados sensores e função, convertendo um evento de vinculação em um sinal elétrico. As performances e sensibilidades de todos os biossensores baseados em anticorpos são fortemente dependentes essencialmente de dois parâmetros: i) a qualidade do anticorpo e ii) e as propriedades do sistema usado para gerar o sinal2.
Os anticorpos são proteínas massa dimérica high-molecular (150 – 160 kDa) são compostos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A interação entre as cadeias leves e pesadas é estabilizada principalmente por interações hidrofóbicas, bem como uma ligação dissulfureto conservada. Cada cadeia inclui um domínio variável que interage com o antígeno essencialmente através de três regiões hipervariáveis chamado complementar determinando regiões (CDR1-2-3). Apesar dos inúmeros avanços no campo, a expressão em grande escala de anticorpos completos com sistemas de expressão de baixo custo (por exemplo, Escherichia coli), muitas vezes leva à produção de proteínas instáveis e agregadas. É por isso que vários fragmentos de anticorpos têm sido projetados tais como variável de cadeia única de fragmentos3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Eles consistem os domínios variáveis de respectivamente um pesado e um cadeias leves que são covalentemente ligados por uma sequência de aminoácidos sintéticos. No entanto, esses fragmentos frequentemente exibir uma pobre estabilidade e têm a tendência de agregar, uma vez que expõem uma grande parcela de suas regiões hidrofóbicas para o solvente4. Neste contexto, fragmentos de anticorpos camelid única cadeia, conhecidos como nanobodies ou VHHs, parecem ser excelentes alternativas para ScFvs. Estes domínios correspondem os domínios variáveis de anticorpos de cadeia única camelid. Em contraste com anticorpos convencionais, camelid anticorpos são desprovidas de cadeias leves e contenham apenas duas correntes pesadas5. Portanto, nanobodies são os menor monomérico fragmentos de anticorpos (12 kDa) podem ligar a um antígeno com afinidade semelhante de anticorpos convencional6. Além disso, eles apresentam melhor estabilidade e solubilidade em comparação com outros anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos. Finalmente, suas dimensões reduzidas e sua prolongada CDR3 loops que lhes permitam reconhecem epitopos crípticos e vincular a enzima sites ativos7,8. Hoje em dia, estes domínios estão recebendo atenção considerável e foram combinados com a tecnologia biosensor. Por exemplo, Huang et al. desenvolveram um biossensor baseado em nanobody para a detecção e quantificação de humano antígeno prostático específico (PSA)9.
Como mencionado acima, um parâmetro importante em ensaios de biosensor é a eficiência do sistema usado para gerar o sinal elétrico. Por esta razão, biosensores eletroquímicos enzimáticos têm atraído cada vez mais atenção e tem sido usados amplamente para várias aplicações tais como cuidados de saúde, segurança alimentar e monitoramento ambiental. Estes biosensores dependem a hidrólise catalítica de um substrato por uma enzima para gerar o sinal elétrico. Neste contexto, β-lactamases foram mostrados para ser mais específico, mais sensível e mais fácil de implementar do que muitas outras enzimas como a fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano10experimentalmente. Β-lactamases são enzimas que são responsáveis pela resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos por hidrólise de-los. Eles são monoméricos, muito estável, eficiente e de tamanho pequeno. Além disso, inserções de domínio/peptídeo em β-lactamases geram proteínas quiméricas bi-funcionais que foram mostradas para ser instrumentos eficazes para estudar as interações proteína-ligante. De fato, estudos recentes têm mostrado essa inserção da variável fragmentos de anticorpos para os resultados de β-lactamase TEM1 em uma proteína quimérico que continua a ser capaz de ligar-se com alta afinidade ao seu antígeno alvo. Curiosamente, a ligação do antígeno foi mostrada para induzir alostérica de TEM1 atividade catalítica11,12. Além disso, mostramos em vários estudos que a inserção de domínio de proteína em um loop de permissiva do Bacillus licheniformis BlaP β-lactamases gera proteínas quiméricas funcionais que são adequadas para monitorar as interações proteína-ligante13 ,14. Recentemente, nós inserimos um nanobody, denominado cAb-Lys3, para este site de inserção permissiva do BlaP15. Este nanobody foi mostrado para vincular a galinha-de-ovo lisozima (HEWL) e para inibir a atividade enzimática de16. Nós mostramos que a proteína gerada híbrido, chamada BlaP-táxi-Lys3, manteve uma alta especificidade / afinidade contra HEWL enquanto a atividade de β-lactamase permaneceu inalterada. Então nós com sucesso combinado com a tecnologia de β-lactamases de híbrido de um biosensor eletroquímico e mostrou que a quantidade de sinal elétrico gerado era dependente da interação entre BlaP-táxi-Lys3 e HEWL imobilizada em um eletrodo. Com efeito, hidrólise da β-lactâmicos por BlaP induz uma liberação de prótons que pode ser convertida em um sinal elétrico quantitativo. Esta combinação da tecnologia híbrida de β-lactamase com um biosensor eletroquímico é rápido, quantitativo e permite a medição em tempo real do sinal gerado. Esta metodologia é descrita neste documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho apresentamos um método para funcionalizar um nanobody usando o BlaP β-lactamase como uma proteína transportadora e mostramos que podemos implementar com êxito a proteína híbrida resultante em um ensaio de sensor potenciométrico. O aspecto principal inovação do nosso trabalho em comparação com outros ensaios biosensor é o acoplamento covalente da parte de anticorpo para a atividade enzimática que gera o sinal elétrico. Esta tecnologia de inserção de proteína chamada apresenta vantagens e li…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o Valão região da Bélgica, no âmbito dos projectos de investigação SENSOTEM e NANOTIC, bem como o nacional fundos para a investigação científica (F.R.S-F.N.R.S) pelo apoio financeiro.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
Riferimenti
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