Biyomoleküler etkileşimleri algılamak için bir Conductimetric Biyoalgılayıcı β-lactamase tabanlı tahlil kullanımı
Summary
Bu çalışmada, protein-protein etkileşimleri hibrid β-lactamase teknolojisini temel alan bir conductimetric Biyoalgılayıcı kullanarak eğitim için yeni bir yöntem rapor. Bu yöntem proton β-lactams hidroliz üzerine sürümü kullanır.
Abstract
Biyosensörler patojen algılama, moleküler tanı, çevresel izleme ve gıda güvenliği denetimi gibi çeşitli alanlarda uygulanan ve giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu bağlamda, çeşitli protein-protein etkileşim çalışmaları verimli muhabir enzimler olarak β-laktamaz kullanılır. Ayrıca, eklemeleri ve peptidler yapısal proteinler/etki alanlarının kuvvetle kabul yeteneğini chimeric proteinleri oluşturmak için bu enzimler kullanımı teşvik eder. Bir son çalışmada, Bacillus licheniformis Bağdat β-lactamase bir tek etki alanı antikor parçası eklenir. Nanobodies, adı da verilen bu küçük etki alanları üzerinden Devegiller tek zincir antikorların antijen bağlayıcı etki alanları olarak tanımlanır. Ortak çift zincir antikorlar gibi gösteriyorlar yüksek benzeşim ve özelliklerine kendi hedefleri için. Elde edilen chimeric protein β-lactamase aktivite korurken hedefine karşı yüksek bir yakınlık sergiledi. Bu nanobody ve β-lactamase moieties işlevsel kalır göstermektedir. Mevcut çalışma, biz Biyoalgılayıcı teknoloji hibrid β-lactamase sistemi birleştirir detaylı bir protokol raporu. Nanobody hedefine için özel bağlayıcı enzimin katalitik aktivitesi tarafından yayımlanan proton conductimetric bir ölçüm sayesinde tespit edilebilir.
Introduction
Biyosensörler fiziksel veya kimyasal sinyal aygıtları için güç çeviriciler1adlandırılan biyo moleküler bir etkileşim birleştirmek analitik cihazlar vardır. Kaydedilen sinyalleri yorumlanır ve immobilize ve ücretsiz ortakları arasındaki etkileşimleri izlemek için dönüştürülür. Biyosensörler çoğu analitler hormonlar veya farklı patojen işaretleri2gibi algılamak için bir antikor kullanımı gerektirir. Farklı sensör biçimleri kullanılabilir ve kitle tabanlı, manyetik, optik ve elektrokimyasal biyosensörler içerir. İkincisi arasında en sık kullanılan sensörler vardır ve bir bağlama olayı elektrik sinyaline dönüştürerek işlev. Performansları ve hassasiyetleri tüm antikor tabanlı biyosensörler, güçlü aslında iki parametre üzerinde bağlıdır: i) antikor ve II)2sinyal oluşturmak için kullanılan sistem özelliklerini kalitesi.
Antikorlar iki ağır zincir ve iki hafif zincirleri oluşan yüksek moleküler kütlesi dimerik (150-160 kDa) proteinlerdir. Hafif ve ağır zincirleri arasındaki etkileşimi çoğunlukla hidrofobik etkileşimler yanı sıra bir korunmuş disülfür bağ stabil. Her zincir antijen aslında tamamlayıcı belirlenmesi bölgeleri (CDR1-2-3) adlı üç hypervariable bölgeler ile etkileşim bir değişken etki alanı içerir. Alan, tam uzunlukta antikorlar düşük maliyetli ifade sistemleri (örneğin, E. coli) ile büyük ölçekli bir ifade çok sayıda gelişmeler rağmen genellikle istikrarsız ve toplanan protein üretimi için açar. Bu yüzden3 (ScFvs ≈ 25 kDa) tek-zinciri değişken parçaları gibi çeşitli antikor parçaları mühendislik. Bunlar sırasıyla bir ağır ve kovalent sentetik amino asit dizisi tarafından bağlanan bir hafif zincirleri değişken etki alanından oluşur. Ancak, bu parçaları kez zavallı bir istikrar görüntülemek ve toplamak, onların hidrofobik bölgeler solvent4büyük bir bölümünü ortaya çıkarmak bu yana eğilimi var. Bu bağlamda, tek zincir Devegiller antikor parçaları, nanobodies veya VHHs, olarak anılacaktır ScFvs mükemmel alternatifler görünmektedir. Bu etki alanları Devegiller tek zincir antikorlar değişken adlarına karşılık. Geleneksel antikorlar, aksine Devegiller antikorlar yoksun hafif zincirleri yüklenir ve yalnızca iki ağır zincir5içerir. Bu nedenle, nanobodies en küçük monomeric antikor (12 kDa) geleneksel antikorlar6için benzer bir ilgi ile bir antijen bağlamak mümkün oluşuyor. Ayrıca, geliştirilmiş kararlılık ve diğer tam uzunlukta antikorlar veya antikor parçaları ile karşılaştırıldığında çözünürlük mevcut. Son olarak, kendi küçük boyutları ve genişletilmiş kendi CDR3 döngüleri onları şifreli epitopları tanımak ve enzim etkin sitelere7,8‘ e bağlamak izin verir. Günümüzde, bu etki alanlarının büyük ilgi alıyorsanız ve Biyoalgılayıcı teknoloji kombine edilmiştir. Örneğin, Huang ve ark. nanobody tabanlı Biyoalgılayıcı algılama ve miktar insan Prostat spesifik antijen (PSA)9için geliştirdik.
Bahsedilen-yukarıda olarak, elektrik sinyal oluşturmak için kullanılan sistemin verimliliği Biyoalgılayıcı deneyleri önemli bir parametre belirtilir. Bu nedenle, elektrokimyasal biyosensörler enzim tabanlı artan ilgisini çekti var ve sağlık, gıda güvenliği ve çevre izleme gibi çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu biyosensörler bir substrat katalitik hidroliz üzerinde elektrik sinyali oluşturmak için sana bir enzim tarafından güveniyor. Bu bağlamda, β-laktamaz daha belirli, daha duyarlı ve kolaylaştırmak alkalen fosfataz veya horseradish peroksidaz10gibi birçok diğer enzimler deneysel olarak gösterilmiştir. Β-laktamaz onları hidrolize tarafından Beta-laktam antibiyotik bakteriyel direnç sorumlu olan enzimlerdir. Onlar monomeric, çok kararlı, verimli ve küçük boyutu var. Ayrıca, etki alanı/peptid eklemeleri β-laktamaz içine protein-ligand etkileşimleri eğitim için verimli araçlar olmak gösterildi BI fonksiyonel chimeric proteinleri üretir. Gerçekten de, son yıllarda yapılan çalışmalarda TEM1 β-lactamase sonuçları antikor değişken parçaları bu ekleme onun hedef antijen için yüksek benzeşimli bağlamak mümkün kalır bir chimeric protein göstermiştir. İlginçtir, antijen bağlayıcı TEM1 katalitik aktivitesi11,12allosteric yönetmelik ikna etmek için gösterildi. Ayrıca, protein etki alanı ekleme izin veren bir döngü Bacillus licheniformis Bağdat β-lactamase protein-ligand etkileşimleri13 izlemek için uygundur fonksiyonel chimeric proteinler oluşturduğu çeşitli çalışmalarda gösterdi ,14. Biz son zamanlarda taksi-Lys3, Bağdat15bu keyfi ekleme site adında bir nanobody takılı. Bu nanobody tavuk-yumurta-beyaz lizozim (HEWL) bağlamak için ve onun enzimatik aktivite16etkisizleştirmek için gösterildi. Biz Bağdat-taksi-Lys3, adında oluşturulan melez protein yüksek özgüllük muhafaza / β-lactamase aktivite kaldı HEWL karşı benzeşme değişmeden gösterdi. Sonra başarıyla hibrid β-lactamase teknolojisi bir elektrokimyasal Biyoalgılayıcı için kombine ve üretilen elektrik sinyal miktarı Bağdat-taksi-Lys3 ve bir elektrot üzerinde immobilize HEWL arasındaki etkileşimin bağımlı olduğunu gösterdi. Nitekim, β-laktam antibiyotik Bağdat tarafından hidroliz nicel bir elektrik sinyali dönüştürülebilir bir proton açıklaması neden olmaktadır. Bu birleşimi bir elektrokimyasal Biyoalgılayıcı hibrid β-lactamase teknolojisiyle hızlı, hassas, nicel ve üretilen sinyal gerçek zamanlı ölçüm sağlar. Bu metodoloji burada açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada biz Bağdat β-lactamase bir taşıyıcı protein kullanarak bir nanobody functionalize için bir yöntem mevcut ve biz başarılı bir şekilde potentiometric sensör assay olarak elde edilen melez protein uygulayabilirsiniz göstereceğiz. Kovalent kaplin elektrik sinyali üretir enzimatik aktivite için antikor bölümünün diğer Biyoalgılayıcı deneyleri için karşılaştırıldığında çalışmalarımızın ana yenilik yönüdür. Bu sözde protein ekleme teknoloji avantajları ve bu bölümü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Valon bölgesi, Belçika SENSOTEM ve NANOTIC araştırma projeleri çerçevesinde yanı sıra ulusal fon için bilimsel araştırma (F.R.S.-F.N.R.S) finansal destek için kabul.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
Riferimenti
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
