Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

Summary

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Abstract

L'identificazione di un epitopo antigenico da parte del sistema immunitario permette la comprensione del meccanismo di protezione di anticorpi neutralizzanti che possono facilitare lo sviluppo di vaccini e farmaci peptidici. scansione Peptide è un metodo semplice ed efficace che mappa semplicemente l'epitopo lineare riconosciuto da un anticorpo monoclonale (mAb). Qui, gli autori presentano una metodologia di determinazione epitopi che coinvolge le proteine ​​ricombinanti in serie tronche, design peptide sintetico, e dot-blot ibridazione per il riconoscimento antigenico di proteina di rivestimento del virus della necrosi nervoso utilizzando un anticorpo monoclonale neutralizzante. Questa tecnica si basa sulla ibridazione dot-blot di peptidi sintetici e mAbs su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). La regione minima antigenica di una proteina di rivestimento virale riconosciuta dalla RG-M56 mAb può essere ridotto passo-passo guarniti mappatura peptide su un peptide epitopo 6-mer. Inoltre, la scansione alanina mutagenesi e residui subsostituzioni con può essere effettuata per caratterizzare il significato di legame di ogni residuo di amminoacido costituente l'epitopo. I residui che fiancheggiano il sito epitopi sono stati trovati a svolgere un ruolo critico nella regolazione del peptide conformazione. Il peptide epitopo identificata può essere usato per formare cristalli di epitopi complessi peptide-anticorpo per uno studio x-ray diffrazione e la concorrenza funzionali, o terapeutica.

Introduction

Nel sistema immunitario, la ricombinazione di segmenti V, D, J e permette agli anticorpi di creare enormi variazioni di complementarietà determinazione regioni (CDR) per il legame ai vari antigeni per proteggere l'host da infezione patogena. La difesa di neutralizzazione degli anticorpi contro gli antigeni dipende dalla complementarità spaziale tra i CDR degli anticorpi e gli epitopi degli antigeni. Pertanto, la comprensione di questa interazione molecolare aiuterà disegno vaccino profilattico e terapeutico sviluppo peptide farmaci. Tuttavia, questa interazione neutralizzazione può essere influenzato sia dalla più domini antigenici da un singolo antigene e da più CDR di anticorpi, che di conseguenza rendono il processo determinazione epitopo più complesso. Fortunatamente, lo sviluppo della tecnologia degli ibridomi, che fonde singole cellule produttrici di anticorpi con cellule di mieloma, consente un lotto costantemente dividendo di cellule secrete un anticorpo specifico, noto come un anticorpo monoclonale (mAb) ^1. cellule di ibridoma producono questi puri, ad alta affinità anticorpi monoclonali di legarsi a un singolo dominio antigenica di un antigene specifico. Con il rapporto di antigene-anticorpo stabilito, diversi approcci, tra cui la scansione peptide, può essere utilizzato per determinare l'epitopo di un antigene utilizzando il mAb corrispondente. I recenti sviluppi nella tecnologia peptide sintetico hanno reso la tecnica di scansione peptide più accessibile e più conveniente per effettuare. Brevemente, un insieme di sovrapposizione peptidi sintetici sono prodotti secondo una sequenza antigene bersaglio e sono associate ad una membrana solido supportato per mAb ibridazione. scansione Peptide non solo offre un modo semplice per mappare la regione di legame dell'anticorpo, ma facilita anche aminoacidi (aa) mutagenesi tramite scansione residuo o di sostituzione per valutare l'interazione vincolante tra ciascun residuo aa del peptide epitopo e REC dell'anticorpo.

<p class = "jove_content"> Qui, il presente studio descrive un protocollo per l'identificazione efficiente della epitopo lineare della proteina di rivestimento giallo cernie virus della necrosi nervosa (YGNNV) utilizzando un neutralizzante mAb ^{2, 3, 4.} Il protocollo include mAb la preparazione, la costruzione e l'espressione di proteine ​​ricombinanti in serie tronche, sintetico disegno peptide sovrapposizione, dot-blot ibridazione, la scansione alanina, e la sostituzione mutagenesi. Considerando il costo elevato di sintesi peptidica, la fase di troncare serialmente le proteine ​​ricombinanti di una proteina bersaglio desiderato è stato modificato, e la regione antigenica è stata ridotta a circa 100 a 200 residui aa prima dell'esecuzione del sintetico matrice peptide analisi dot-blot.

Protocol

1. Preparazione di anticorpo monoclonale Cultura i monoclonali murini cellule di ibridoma RG-M56 2 in terreno privo di siero in fiaschi 175T a 37 ° C con 5% di CO 2 supplemento. Raccogliere il surnatante quando il colore del mezzo diventa giallo dopo cinque giorni di incubazione. NOTA: cellule di ibridoma sono state coltivate in terreno privo di siero per evitare la contaminazione di anticorpi da siero bovino fetale. Centrifugare il surnatante a 4.500 xg pe…

Representative Results

L'obiettivo di questo esperimento è stato quello di identificare un epitopo attraverso dot assorbente con anticorpo monoclonale. Per restringere rapidamente ed efficientemente giù regione antigenica riconosciuto dal mAb, l'intera lunghezza e proteine di rivestimento ricombinante YGNNV serialmente troncati con un tag di fusione 6xHis al C-terminale sono stati espressi da un sistema di espressione di E. coli PET 10 (Figura 1A). Le…

Discussion

Questo protocollo offre una tecnica rapida e semplice per identificare un epitopo lineare MAB-riconosciuto. Prendendo in considerazione il costo di sintesi peptidica e l'efficienza di produzione di peptidi sintetizzare, la regione antigenica della proteina di rivestimento del virus è stata ridotta di esprimere proteine ​​ricombinanti serialmente tronche prima dell'analisi scansione peptide. Come tale, il sistema affidabile ed efficiente espressione di E. coli pET stato usato per produrre queste pro…

Materials

Hybrid-SFM medium	Gibco	12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0502	Including buffers
T4 DNA Ligase	Roche	10799009001	Including buffers
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Including buffers
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Including buffers
pET-20b(+) vector	Novagen, Merck Millipore	69739
E.coli DH-5α competent cell	RBC Bioscience	RH617
E.coli BL-21(DE3) competent cell	RBC Bioscience	RH217
Ampicillin	Amresco	0339-25G
LB broth	Invitrongen	12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Methanol	Merck Millipore	106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Glycine	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glycerol	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody	Jackson ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Image System	UVP	n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8	UVP	n/a
MyCycler thermal cycler	BioRad	1709713