Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

Summary

Qui, gli autori presentano un protocollo semplice ed efficiente per definire un epitopo antigenico lineare utilizzando un anticorpo monoclonale purificato e la scansione dei peptidi attraverso l'ibridazione dot-blot. L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in applicazioni terapeutiche e diagnostiche.

Abstract

L'identificazione di un epitopo antigenico da parte del sistema immunitario permette la comprensione del meccanismo di protezione di anticorpi neutralizzanti che possono facilitare lo sviluppo di vaccini e farmaci peptidici. scansione Peptide è un metodo semplice ed efficace che mappa semplicemente l'epitopo lineare riconosciuto da un anticorpo monoclonale (mAb). Qui, gli autori presentano una metodologia di determinazione epitopi che coinvolge le proteine ​​ricombinanti in serie tronche, design peptide sintetico, e dot-blot ibridazione per il riconoscimento antigenico di proteina di rivestimento del virus della necrosi nervoso utilizzando un anticorpo monoclonale neutralizzante. Questa tecnica si basa sulla ibridazione dot-blot di peptidi sintetici e mAbs su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). La regione minima antigenica di una proteina di rivestimento virale riconosciuta dalla RG-M56 mAb può essere ridotto passo-passo guarniti mappatura peptide su un peptide epitopo 6-mer. Inoltre, la scansione alanina mutagenesi e residui subsostituzioni con può essere effettuata per caratterizzare il significato di legame di ogni residuo di amminoacido costituente l'epitopo. I residui che fiancheggiano il sito epitopi sono stati trovati a svolgere un ruolo critico nella regolazione del peptide conformazione. Il peptide epitopo identificata può essere usato per formare cristalli di epitopi complessi peptide-anticorpo per uno studio x-ray diffrazione e la concorrenza funzionali, o terapeutica.

Introduction

Nel sistema immunitario, la ricombinazione di segmenti V, D, J e permette agli anticorpi di creare enormi variazioni di complementarietà determinazione regioni (CDR) per il legame ai vari antigeni per proteggere l'host da infezione patogena. La difesa di neutralizzazione degli anticorpi contro gli antigeni dipende dalla complementarità spaziale tra i CDR degli anticorpi e gli epitopi degli antigeni. Pertanto, la comprensione di questa interazione molecolare aiuterà disegno vaccino profilattico e terapeutico sviluppo peptide farmaci. Tuttavia, questa interazione neutralizzazione può essere influenzato sia dalla più domini antigenici da u....

Protocol

1. Preparazione di anticorpo monoclonale

1. Cultura i monoclonali murini cellule di ibridoma RG-M56 ² in terreno privo di siero in fiaschi 175T a 37 ° C con 5% di CO ₂ supplemento. Raccogliere il surnatante quando il colore del mezzo diventa giallo dopo cinque giorni di incubazione.
   NOTA: cellule di ibridoma sono state coltivate in terreno privo di siero per evitare la contaminazione di anticorpi da siero bovino fetale.
2. Centrifugare il surnatante a 4.500 xg per 30 minuti a 4 ° C e scartare il pellet residui cellulari.
3. Aggiungere 2 ml di agarosio proteina G (fornito come un impasto 50%) per una colo....

Results

L'obiettivo di questo esperimento è stato quello di identificare un epitopo attraverso dot assorbente con anticorpo monoclonale. Per restringere rapidamente ed efficientemente giù regione antigenica riconosciuto dal mAb, l'intera lunghezza e proteine di rivestimento ricombinante YGNNV serialmente troncati con un tag di fusione 6xHis al C-terminale sono stati espressi da un sistema di espressione di E. coli PET ¹⁰ (Figura 1A). Le proteine .......

Discussion

Questo protocollo offre una tecnica rapida e semplice per identificare un epitopo lineare MAB-riconosciuto. Prendendo in considerazione il costo di sintesi peptidica e l'efficienza di produzione di peptidi sintetizzare, la regione antigenica della proteina di rivestimento del virus è stata ridotta di esprimere proteine ​​ricombinanti serialmente tronche prima dell'analisi scansione peptide. Come tale, il sistema affidabile ed efficiente espressione di E. coli pET stato usato per produrre queste proteine.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ibrido-SFM medio	Gibco	12045-076
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeccos (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu DNA polimerasi	Thermo Scientific	EP0502	Compresi i buffer
T4 DNA ligasi	Roche	10799009001	compresi i tamponi
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Compresi i tamponi
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Compresi i tamponi
pET-20b (+) vettore	Novagen, Merck Millipore	69739<
em>E. coli DH-5α cellula competente	RBC Bioscience	RH617
E. coli BL-21 (DE3) cellula competente	RBC Bioscience	RH217
Ampicillina	Amresco	0339-25G
Brodo LB	Invitrongen	12780-052
Isopropiltio-beta;-D-tiogalattoside (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Metanolo	Merck Millipore	106009
Poliossietilene 20 Monolaurato di sorbitano (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma	D2650
Glicina	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glicerolo	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
IgG anti-topo di capra, anticorpo frammento Fc	Jackson ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (fluoruro di polivinilidene, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
proteina G Agarosio Flusso rapido	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Kit di purificazione	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Sistema di immagini	UVP	n/a
Software di analisi VisionWorks LS Ver 6.8	UVP	n/a
Termociclatore MyCycler	BioRad	1709713