פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
הזיהוי של אפיטופ אנטיגני על ידי המערכת החיסונית מאפשרת הבנה של מנגנון הגנה של נוגדנים מנטרלים שעשויים להקל על פיתוח של חיסונים ותרופות פפטיד. סריקת פפטיד היא שיטה פשוטה ויעילה הממפה את epitope ליניארי המוכר בצורה ישירה על ידי נוגדן חד-שבטי (מב). הנה, המחברים מציגים מתודולוגיה נחישות epitope המעורבת חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי, כלת dot-כתם להכרה אנטיגני של חלבון מעייל וירוס עצבים נימקו באמצעות מב נטרול. טכניקה זו מסתמכת על הכלאה dot-כתם של פפטידים סינתטיים מבז על פלואוריד polyvinylidene הממברנה (PVDF). האזור אנטיגני מינימום של חלבון מעיל ויראלי מוכר על ידי מב RG-M56 יכול להיות הצטמצם אחר צעד-אחר-צעד גזוז מיפוי פפטיד גבי epitope פפטיד 6-mer. בנוסף, סריקה אלאנין תת mutagenesis שאריותstitution ניתן לבצע כדי לאפיין את המשמעות המחייבת של כל שאריות חומצת אמינו המרכיבות את epitope. שאריות איגוף באתר epitope נמצאו לשחק תפקידים קריטיים בתקנה קונפורמציה פפטיד. הפפטיד epitope זיהה ניתן להשתמש כדי ליצור גבישים של מתחמי פפטיד-נוגדן epitope עבור מחקר עקיף של קרני רנטגן ותחרות פונקציונלית, או רפוי.
Introduction
במערכת החיסונית, רקומבינציה של V, D, ומגזרי J מאפשרת נוגדנים ליצור מגוון גדול של אזורים בקביעת מידת השלמה (CDRs) לכריכה לאנטיגנים שונים שנועד להגן על המארח מזיהום פתוגניים. הגנת הנטרול של נוגדנים נגד אנטיגנים תלוי ההשלמה מרחבית בין CDRs של נוגדנים ואת אפיטופים של אנטיגנים. לכן, הבנה של אינטראקציה מולקולרית זה תסייע עיצוב חיסון מניעתי ופיתוח תרופות פפטיד טיפולי. עם זאת, אינטראקצית נטרול זה עשוי להיות מושפע הוא על ידי תחומים אנטיגני מרובים אנטיגן אחד ועל ידי מספר CDRs של נוגדנים, אשר כתוצאה מכך להפוך את תהליך קביעת epitope מורכב יותר. למרבה המזל, את הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma, ממזגת תאי מייצרי נוגדני פרט עם תאי מיאלומה, מאפשר לאפיית חלוקת זמן של תאים שניים rete אחד נוגדן ספציפי, המכונה נוגדן חד-שבטי (מב) 1. תאי Hybridoma לייצר זיקה גבוהה טהור, אלה מבז להיקשר תחום אנטיגני יחיד של אנטיגן ספציפי. עם היחס של הנוגדן לאנטיגן הוקמה, מספר גישות, כולל סריקה פפטיד, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את epitope של אנטיגן באמצעות מב המתאימה לו. ההתפתחויות האחרונות בתחום הטכנולוגיה פפטיד סינתטי הפכו את טכניקת הסריקה פפטיד נגיש יותר ונוח יותר לבצע. בקצרה, קבוצה של פפטידים סינתטיים חופפים מיוצרים על פי רצף אנטיגן היעד והן קשורות אל קרום מוצק נתמך הכלאה מב. סריקת פפטיד לא רק מציעה דרך פשוטה כדי למפות את הנוגדן מחייב באזור, אלא גם הופכת לפשוט חומצות אמיניות (AA) mutagenesis באמצעות סריקת שאריות או החלפה כדי להעריך את האינטראקציה מחייבת בין כל שאריות aa של הפפטיד epitope ואת CDRs של הנוגדן.
<p c= ילדה "jove_content"> כאן, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לזיהוי יעיל של epitope ליניארי של הנגיף נמק צהוב לוקוס עצבים (YGNNV) חלבון מעיל באמצעות מב נטרול 2, 3, 4. הפרוטוקול כולל הכנת מב, בניית ביטוי של חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי חופף, כלת dot-כתם, סריקת אלאנין, ו mutagenesis חילוף. בהתחשב בעלות הגבוהה של סינתזת פפטיד, הצעד של מקצץ את החלבונים רקומביננטי הסדרה של חלבון מטרה רצויה שונה, ואזור אנטיגני הצטמצם סביב 100 עד 200 שאריות aa לפני ניתוח dot-כתם מערך פפטיד הסינטטי בוצע.Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציע טכניקה מהירה וישירה לזהות epitope ליניארי מוכר-מב. אם ניקח בחשבון את העלות של סינתזה פפטיד ואת יעילות הייצור של פפטידים וסינתזה, באזור אנטיגני של חלבון מעיל וירוס הופחת על ידי הבעת חלבונים רקומביננטיים קטום סדרתי לפני ניתוח סריקה פפטיד. ככזה, מערכת הביט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
