Peptide Scanning-bijgestaan Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
De identificatie van een antigeen epitoop door het immuunsysteem zorgt voor het begrijpen van het beschermingsmechanisme van neutraliserende antilichamen die de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen peptide kan vergemakkelijken. Peptide scannen is een eenvoudige en efficiënte methode die rechtlijnig brengt de lineaire epitoop herkend door een monoklonaal antilichaam (mAb). Hier de auteurs presenteren een epitoop bepaling methodiek waarbij serieel afgeknotte recombinante eiwitten, synthetisch peptide ontwerp en dot-blot hybridisatie voor de antigene herkenning van nerveuze necrose virus manteleiwit met behulp van een neutraliserende mAb. Deze techniek is gebaseerd op de dot-blot hybridisatie van synthetische peptiden en mAbs op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. De minimale antigeen gebied van een viraal manteleiwit herkend door de RG-M56 mAb kan teruggebracht worden stap voor stap bijgesneden peptide mapping op een 6-meer peptide epitoop. Bovendien, alanine scanning mutagenese en residuen substitutie kan worden uitgevoerd om de binding betekenis van elke aminozuurrest die het epitoop karakteriseren. De resten aan weerszijden van de epitoop website bleken cruciale rol in peptide conformatie regelgeving spelen. Het geïdentificeerde epitoop peptide kan worden gebruikt om kristallen van epitoop peptide-antilichaam complexen een röntgendiffractie onderzoek en functionele concurrentie, of therapeutische vormen.
Introduction
In het immuunsysteem, de recombinatie van V-, D- en J-segmenten zorgt voor antilichamen tegen enorme variaties van complementariteitsbepalende gebieden (CDR's) te creëren voor binding aan verschillende antigenen aan de host pathogene infectie te beschermen. De verdediging neutraliserende antilichamen tegen antigenen afhankelijk van de ruimtelijke complementariteit van de CDR's van de antilichamen en de epitopen van de antigenen. Daarom zal een begrip van deze moleculaire interactie profylactisch vaccin ontwerp en therapeutische ontwikkeling peptide helpen. Dit kan echter neutralisatie interactie beïnvloed door zowel meerdere antigene domeinen van één antigeen en door meerdere CDR's van antilichamen, die bijgevolg het epitoop behandelingsprocedure complexer. Gelukkig is de ontwikkeling van hybridoma technologie, die afzonderlijke antilichaamproducerende cellen ondersteunen gen met myelomacellen, zorgt voor een constant delende partij cellen secrete een specifiek antilichaam, bekend als een monoklonaal antilichaam (mAb) 1. Hybridoma cellen die zuivere hoge affiniteit mAbs binden aan een enkele antigene domein van een specifiek antigeen. De verhouding van het antigeen-antilichaam gevestigde verschillende manieren, waaronder peptide scannen, kan worden gebruikt om het epitoop van een antigeen via de bijbehorende mAb te bepalen. Recente ontwikkelingen in de synthetische peptide technologie hebben het peptide scantechniek toegankelijker en handiger te voeren gemaakt. Kort samengevat, een set van overlappende synthetische peptiden worden geproduceerd volgens een doelantigeen sequentie en worden gekoppeld aan een vaste drager membraan mAb hybridisatie. Peptide scanning biedt niet alleen een eenvoudige manier aan het antilichaam bindingsgebied kaart, maar vergemakkelijkt ook aminozuur (aa) mutagenese met scannen of residu substitutie de bindingsinteractie tussen elke aa residu van het epitoop peptide en de CDR's van het antilichaam te beoordelen.
<p class = "jove_content"> Hier de huidige studie beschrijft een protocol voor de efficiënte identificatie van het lineaire epitoop van de gele grouper nerveuze necrose (YGNNV) manteleiwit met een neutraliserende mAb 2, 3, 4. Het protocol omvat mAb preparaat, constructie en expressie van serieel afgeknotte recombinante eiwitten, synthetische peptiden overlappend ontwerp, dot-blot hybridisatie, alanine scanning en substitutie mutagenese. Gezien de hoge kosten van peptidesynthese, de stap van het serieel afkappen de recombinante eiwitten van een gewenst doeleiwit werd gewijzigd en het antigene gebied werd teruggebracht tot ongeveer 100 tot 200 aa resten voor het synthetische peptide matrix dot-blotanalyse werd uitgevoerd.Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een snelle en eenvoudige techniek om een lineaire mAb herkende epitoop te identificeren. Gezien de kosten van peptidesynthese en de productie-efficiëntie van het synthetiseren van peptiden de antigene gebied van het virus manteleiwit werd verminderd tot expressie serieel afgeknotte recombinante eiwitten voor peptide-scanning analyse. Als zodanig werd het betrouwbaar en doelmatig pET E. coli expressiesysteem gebruikt om deze serieel afgeknotte recombinante eiwitten, recombinante eiwitte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
