Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Summary

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Abstract

A identificação de um epítopo antigénico pelo sistema imunológico permite a compreensão do mecanismo de protecção de anticorpos que podem facilitar o desenvolvimento de vacinas e de drogas peptídicas neutralizantes. Péptido de varrimento é um método simples e eficiente, que diretamente mapeia o epitopo linear reconhecido por um anticorpo monoclonal (mAb). Aqui, os autores apresentam uma metodologia de determinação epitopo envolvendo proteínas em série truncadas recombinantes, design peptídeo sintético, e hibridação dot-blot para o reconhecimento antigênico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso usando um mAb neutralizante. Esta técnica baseia-se na hibridação dot-blot de péptidos sintéticos e os mAbs em um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. A região mínima antigénico de uma proteína de revestimento virai reconhecido pelo mAb M56-RG pode ser reduzida por passo-a-passo aparado mapeamento do péptido para um epitopo peptidico 6-mer. Além disso, a mutagénese de varrimento de alanina e o resíduo subtuição pode ser realizado para caracterizar a importância de ligação de cada resíduo de aminoácidos que constituem o epítopo. Os resíduos que flanqueiam o local de epitopo foram encontrados para jogar um papel crítico na regulação da conformação peptídica. O péptido epitopo identificado podem ser usadas para formar cristais de complexos de péptido-anticorpo epitopo para um estudo de difracção de raios-X e a competição funcional, ou para terapêutica.

Introduction

No sistema imunitário, a recombinação de segmentos V, D, J e permite a anticorpos para criar grandes variações de regiões determinantes de complementaridade (CDR) para se ligar a vários antigénios para proteger o hospedeiro contra a infecção patogénica. A defesa de neutralização de anticorpos contra antigénios depende da complementaridade espacial entre as CDR dos anticorpos e os epítopos de antigénios. Portanto, o conhecimento desta interacção irá ajudar molecular concepção de uma vacina profilática e desenvolvimento de fármacos péptido terapêutico. No entanto, esta interacção de neutralização pode ser influenciada tanto por vários domínios antigénicos a partir de um único antigénio e por vários CDRs de anticorpos, os quais, por conseguinte, tornam o processo de determinação epitopo mais complexo. Felizmente, o desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, o qual funde a células produtoras de anticorpos com células de mieloma individuais, permite um lote constante dividindo de células para segrete um anticorpo específico, conhecido como um anticorpo monoclonal (mAb) ^1. As células de hibridoma produzem estes puros, mAb de elevada afinidade para se ligar a um único domínio antigénico de um antigénio específico. Com a relação do anticorpo-antigénio estabelecida, várias abordagens, incluindo varrimento de péptidos, pode ser utilizado para determinar o epítopo de um antigénio usando o mAb correspondente. Desenvolvimentos recentes na tecnologia peptídeo sintético fizeram a técnica de exploração peptídeo mais acessível e mais conveniente para executar. Resumidamente, uma série de péptidos sintéticos que se sobrepõem são produzidos de acordo com uma sequência do antigénio alvo e estão associados a uma membrana em suporte sido para a hibridação de mAb. digitalização péptido não só oferece uma maneira simples para mapear a região de ligação do anticorpo, mas também facilita o aminoácido (AA) por meio de mutagénese de varrimento resíduo ou substituição para avaliar a interacção de ligação entre cada resíduo AA do péptido epítopo e as CDR do anticorpo.

<p class = "jove_content"> Aqui, o presente estudo descreve um protocolo para a identificação eficiente do epitopo linear da proteína de revestimento garoupa amarelo vírus da necrose nervoso (YGNNV) usando um mAb neutralizante ^{2, 3, 4.} O protocolo inclui mAb preparação, a construção e expressão de proteínas recombinantes em série truncadas, de criação de péptidos sintéticos sobrepostos, hibridação dot-blot, o varrimento de alanina, e mutagénese de substituição. Considerando o elevado custo da síntese de péptidos, o passo de truncagem em série das proteínas recombinantes de uma proteína alvo desejado foi modificado, e a região antigénica foi reduzida para cerca de 100 a 200 resíduos aa antes da análise dot-blot matriz peptídica sintética foi realizada.

Protocol

1. Preparação de Anticorpos Monoclonais Cultura dos monoclonais de rato células de hibridoma RG-M56 2 em meio livre de soro em frascos de 175T a 37 ºC com 5% de suplemento de CO 2. Recolhe-se o sobrenadante quando a cor do meio torna-se amarelo após cinco dias de incubação. NOTA: As células de hibridoma foram cultivadas em meio isento de soro a fim de evitar a contaminação de anticorpos a partir de soro fetal de bovino. Centrifuga-se o sobrenadante…

Representative Results

O objetivo deste experimento foi identificar um epitopo através Dot blot usando mAb. Para limitar rapidamente e eficientemente para baixo da região antigénica reconhecido por mAb, a todo o comprimento e proteínas de revestimento recombinante YGNNV truncados em série com uma marcação de fusão 6xHis no terminal C foram expressos a partir de um sistema de expressão de E. coli de PET 10 (Figura 1A). As proteínas recombinantes result…

Discussion

Este protocolo oferece uma técnica rápida e simples para identificar um epitopo linear reconhecido-mAb. Tomando em consideração o custo da síntese de péptidos e da eficiência da produção de péptidos que sintetizam, da região antigénica da proteína de revestimento de vírus foi reduzido por expressão de proteínas recombinantes em série truncados antes da análise de varrimento de péptidos. Como tal, o sistema de expressão pET de E. coli fiável e eficiente foi usado para produzir estas proteín…

Materials

Hybrid-SFM medium	Gibco	12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069
Pfu DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0502	Including buffers
T4 DNA Ligase	Roche	10799009001	Including buffers
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Including buffers
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Including buffers
pET-20b(+) vector	Novagen, Merck Millipore	69739
E.coli DH-5α competent cell	RBC Bioscience	RH617
E.coli BL-21(DE3) competent cell	RBC Bioscience	RH217
Ampicillin	Amresco	0339-25G
LB broth	Invitrongen	12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG)	MDBio, Inc.	101-367-93-1
Methanol	Merck Millipore	106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	J.T.Baker	X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Glycine	Amresco	0167-5KG
Tris	Affymetrix, USB	75825
NaCl	Amresco	0241-1KG
EDTA	Amresco	0105-1KG
Glycerol	Amresco	0854-1L
NaN3	Sigma	S2002-500G
BCIP/NBT	PerkinElmer	NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody	Jackson ImmunoResearch	115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)	Merck Millipore	IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow	Merck Millipore	16-266
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106
UVP BioSpectrum 600 Image System	UVP	n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8	UVP	n/a
MyCycler thermal cycler	BioRad	1709713