펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
면역 시스템에 의해 항원 성 에피토프의 확인은 백신 펩타이드 약물의 개발을 용이하게 할 수있다 중화 항체의 보호 메커니즘을 이해할 수있다. 펩티드 스캐닝 노골적 모노클로 날 항체 (단클론 항체)에 의해 인식되는 선형 에피토프를 맵핑하는 간단하고 효과적인 방법이다. 여기에서, 저자는 중화 단클론 항체를 이용하여 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 인식 직렬 절두 재조합 단백질, 합성 펩티드 설계, 도트 블롯 혼성화를 포함하는 에피토프의 결정 방법을 제안한다. 이러한 기술은 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 합성 펩티드 및 모노클로 날 항체의 도트 블롯 하이브리드 화에 의존한다. RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 바이러스 외피 단백질 항원의 최소 영역은 6 량체 펩티드 에피토프에 펩티드 맵핑을 트리밍 단계별로 좁힐 수있다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 잔여 서브stitution는 에피토프를 구성하는 각각의 아미노산 잔기의 중요성 결합을 특징으로 수행 될 수있다. 에피토프 부위를 플 랭킹 잔기가 펩타이드 형태의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 동정 된 에피토프 펩티드는 X- 선 회절 연구 및 기능적 경쟁 또는 치료학 대한 에피토프 펩타이드 – 항체 복합체의 결정을 형성하는데 사용될 수있다.
Introduction
면역계에서 V, D, 및 J 세그먼트의 재조합 항체는 병원균 감염으로부터 숙주를 보호하는 다양한 항원 결합에 대해 상보성 결정 영역 (CDR을)의 상당한 변화를 생성 할 수있다. 항원에 대한 항체의 중화 방어 항체의 CDR을하고 항원의 에피토프 사이의 공간 상보성에 따라 달라집니다. 따라서이 분자의 상호 작용에 대한 이해는 예방 백신 디자인과 치료 펩티드 약물 개발에 도움이 될 것입니다. 그러나,이 중화 상호 작용은 단일 항원 여러 항원 도메인 의해 결과적 에피토프 결정 처리는 더 복잡하게 항체의 복수 개의 CDR에 의해 모두 영향을받을 수있다. 다행히도, 골수종 세포와 개별 항체 생산 세포를 하이 브리 도마 융합 기술의 개발은, 초 셀 끊임없이 나누어 배치 허용모노클로 날 항체 (단클론)로 알려진 하나의 특정 항체 RETE 1. 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항원 항원의 한 영역에 결합하는 이들의 순수한 고 친 화성 모노클로 날 항체를 생산한다. 확립 된 항원 – 항체, 펩티드 주사 등 여러 방식의 관계를, 그 대응하는 단클론 항체를 이용하여 항원의 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수있다. 합성 펩타이드 기술의 최근 발전은 펩타이드 스캐닝 기술은 더 접근하고 수행하는 것이 더 편리 만들었습니다. 간단히, 중복 합성 펩티드의 세트는 표적 항원 서열에 따라 제조되고, 단클론 혼성화 고체지지 막에 관련된다. 펩티드 스캐닝 영역을 결합 항체를 맵핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 또한 에피토프 펩티드 각각 AA 잔기 및 항체의 CDR의 결합 상호 작용을 평가하기 위해 잔류 검사 또는 교체를 통해 아미노산 (AA) 돌연변이를 용이 아닙니다.
<p c아가씨 = "jove_content는"> 여기서, 본 연구에서는 중화 단클론 2, 3, 4를 이용하여 노란색 그루퍼 신경 괴사 바이러스 (YGNNV) 외피 단백질의 선형 에피토프의 효율적인 식별을위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 단클론 항체 제조, 건설, 직렬로 절단 된 재조합 단백질의 발현, 합성 중복 펩티드 디자인, 도트 오 하이브리드, 알라닌 검색 및 치환 돌연변이를 포함한다. 펩티드 합성의 높은 비용을 고려하면, 연속적으로 소망하는 목적 단백질의 재조합 단백질을 절단하는 단계는, 수정하고, 합성 펩티드 배열 도트 블롯 분석이 수행되기 전에 항원 성 영역은 약 100 내지 200 AA 잔기 좁혀졌다.Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 단클론 항체 인식 선형 에피토프를 확인하기위한 신속하고 간단한 기술을 제공한다. 고려 펩티드 합성 및 합성 펩티드의 생산 효율의 비용을 고려하여 바이러스 코트 단백질의 항원 성 영역은 펩타이드 주사 분석 전에 연속적으로 절단 재조합 단백질 발현을 감소시켰다. 50-10 사이의 분자량이 kDa의 재조합 단백질은 쉽게 시스템을 통해 표현 될 수 있으므로 따라서, 안정적이고 효?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
