여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 시스템에 의해 항원 성 에피토프의 확인은 백신 펩타이드 약물의 개발을 용이하게 할 수있다 중화 항체의 보호 메커니즘을 이해할 수있다. 펩티드 스캐닝 노골적 모노클로 날 항체 (단클론 항체)에 의해 인식되는 선형 에피토프를 맵핑하는 간단하고 효과적인 방법이다. 여기에서, 저자는 중화 단클론 항체를 이용하여 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 인식 직렬 절두 재조합 단백질, 합성 펩티드 설계, 도트 블롯 혼성화를 포함하는 에피토프의 결정 방법을 제안한다. 이러한 기술은 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 합성 펩티드 및 모노클로 날 항체의 도트 블롯 하이브리드 화에 의존한다. RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 바이러스 외피 단백질 항원의 최소 영역은 6 량체 펩티드 에피토프에 펩티드 맵핑을 트리밍 단계별로 좁힐 수있다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 잔여 서브stitution는 에피토프를 구성하는 각각의 아미노산 잔기의 중요성 결합을 특징으로 수행 될 수있다. 에피토프 부위를 플 랭킹 잔기가 펩타이드 형태의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 동정 된 에피토프 펩티드는 X- 선 회절 연구 및 기능적 경쟁 또는 치료학 대한 에피토프 펩타이드 - 항체 복합체의 결정을 형성하는데 사용될 수있다.
서론
면역계에서 V, D, 및 J 세그먼트의 재조합 항체는 병원균 감염으로부터 숙주를 보호하는 다양한 항원 결합에 대해 상보성 결정 영역 (CDR을)의 상당한 변화를 생성 할 수있다. 항원에 대한 항체의 중화 방어 항체의 CDR을하고 항원의 에피토프 사이의 공간 상보성에 따라 달라집니다. 따라서이 분자의 상호 작용에 대한 이해는 예방 백신 디자인과 치료 펩티드 약물 개발에 도움이 될 것입니다. 그러나,이 중화 상호 작용은 단일 항원 여러 항원 도메인 의해 결과적 에피토프 결정 처리는 더 복잡하게 항체의 복수 개의 CDR에 의해 모두 영향을받을 수있다. 다행히도, 골수종 세포와 개별 항체 생산 세포를 하이 브리 도마 융합 기술의 개발은, 초 셀 끊임없이 나누어 배치 허용모노클로 날 항체 (단클론)로 알려진 하나의 특정 항체 RETE 1. 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항원 항원의 한 영역에 결합하는 이들의 순수한 고 친 화성 모노클로 날 항체를 생산한다. 확립 된 항원 - 항체, 펩티드 주사 등 여러 방식의 관계를, 그 대응하는 단클론 항체를 이용하여 항원의 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수있다. 합성 펩타이드 기술의 최근 발전은 펩타이드 스캐닝 기술은 더 접근하고 수행하는 것이 더 편리 만들었습니다. ....
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프로토콜
단일 클론 항체의 1. 준비
- 배양 5 % CO 2 보충 37 ºC에서 175T 플라스크에서 무 혈청 배지에서 RG-M56 마우스 단클론이 하이 브리 도마 세포. 매체의 색상은 배양 5 일 후 노란색으로 바뀌면 뜨는를 수집합니다.
주 : 하이 브리 도마 세포를 소 태아 혈청으로부터 항체의 오염을 피하기 위해, 무 혈청 배지에서 배양 하였다. - 4 ºC에서 30 분 동안 4,500 XG에 뜨는을 원심 분리기와 세포 파편 펠렛을 폐기합니다.
- 5 mL의 컬럼 (50 % 슬러리로 제공) 단백질 G 아가로 오스의 2 mL를 넣고 얼음처럼 차가운 PBS의 10 수지 볼륨 (10 mL)로 평형.
- 항체 상층 액의로드 200 ㎖ 칼럼 상 (단계 1.2) 및 통과를 폐기합니다.
- 그것을 씻어 칼럼에 얼음처럼 차가운 PBS의 10 ML을 추가합니다. 두 번 반복합니다.
- 단백질 G-관련된 항체를 용출 컬럼에 50 mM의 글리신, 산도 2.7의 10 ML을 추가합니다. 안부[선택] 배 중화 완충액 100 μL (1 M 트리스, 1.5 M의 NaCl, 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 900 μL 분....
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결과
이 실험의 목표는 단클론 항체를 이용하여 블롯을 통해 도트 에피토프를 확인 하였다. 신속하고 효율적으로 단클론 항체에 의해 인식되는 항원 영역을 좁히기 위해, C 말단에 6xHis 융합 태그의 전체 길이와 직렬로 절단 YGNNV 재조합 코트 단백질은 대장균 PET 발현 시스템 (10) (도 1a)에서 발현되었다. 생성 된 재조합 단백질은 도트 블롯 혼성화를 위해 RG-M56 단클론 항체 및 항 6xHis 항체를 이용하여 PVDF 막에 발견되었다. 도트 블롯은 1-338 AA (전체 길이), 51-338 AA 및 195-338 aa는 있지만 1-100 AA 또는 1-200 aa는 재조합 단백질 (그림 1B)에 대해 긍정적 인 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. 도트 배열 항 6xHis 항체에 대해 혼성화 모든 재조합 단백질 발현을 확인 하였다. 이러한 데이.......
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토론
이 프로토콜은 단클론 항체 인식 선형 에피토프를 확인하기위한 신속하고 간단한 기술을 제공한다. 고려 펩티드 합성 및 합성 펩티드의 생산 효율의 비용을 고려하여 바이러스 코트 단백질의 항원 성 영역은 펩타이드 주사 분석 전에 연속적으로 절단 재조합 단백질 발현을 감소시켰다. 50-10 사이의 분자량이 kDa의 재조합 단백질은 쉽게 시스템을 통해 표현 될 수 있으므로 따라서, 안정적이고 효율적인 E. 콜라이 애완 동물 발현 시스템이 순차적으로 절단 된 재조합 단백질을 생산하는 데 사용되었다. 이러한 방식으로, 에피토프는 쉽게 관리하기 100~200 AA 영역까지 좁아 질 수있다. 그것은 제조 6xHis 태그 융합 단백질 허용 6xHis-태그의 발현에 대한 코드의 발현을 확인하기 위해 항 6xHis 항체를 사용 immunodetected되도록하는 서열을 함유로서 애완 동물 (20B) (+) 벡터를 구체적으로 선택되었다 재조합 페이지roteins. 생성 된 재조합 코트 단백질은했다 도트 블롯 혼성화 분석을 통하여 RG.......
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공개 사항
저자는 이 보고서와 관련하여 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 펩타이드 합성과 DNA 염기서열 분석에 대한 전문 지식을 제공해 준 Academia Sinica의 세포 및 유기체 생물학 연구소(ICOB) 핵심 시설의 Miss Ching-Chun Lin과 Miss Diana Lin에게 각각 감사를 표합니다. 이 연구는 Academia Sinica의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 하이브리드-SFM 매체 | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos의 Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA 중합효소 | 써모 사이언티픽 | EP0502 | 버퍼 포함 |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | 완충액 |
| 포함 NdeI | New England Biolabs | R0111S | 완충액 |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | 완충액 |
| 포함 pET-20b(+) 벡터 | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α 유능 세포 | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) 유능 세포 | RBC Bioscience | RH217 | |
| 암피실린 | Amresco | 0339-25G | |
| LB 육수 | Invitrongen | 12780-052 | |
| 이소프로필티오-&베타;-D-티오갈락토시드 (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| 메탄올 | Merck Millipore | 106009 | |
| 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노라우레이트(트윈-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 시그마 | D2650 | |
| 글리신 | Amresco | 0167-5KG | |
| 트리스 | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| 글리세롤 | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment 항체 | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (폴리비닐리덴 플루오라이드, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR 정제 키트, | Qiagen | 28106 | |
| UVP, BioSpectrum 600 이미지 시스템 | UVP | 해당 사항 없음 | |
| VisionWorks LS 분석 소프트웨어 Ver 6.8 | UVP | 해당 없음 | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
참고문헌
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis.
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