Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering av neuronal levedyktighet ved bruk av fluoresceindiacetat-propidiumjodid-dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man nøyaktig måler neuronal levedyktighet ved å bruke fluoresceindiacetat (FDA) og propidiumjodid (PI) dobbeltfarging i dyrkede cerebellargranulæreuroner, en primær nevronkultur som brukes som en in vitro- modell i nevrovitenskapelig og neurofarmakologisk forskning.

Abstract

Primærkulturerte Cerebellar Granule Neurons (CGNs) har blitt mye brukt som en in vitro- modell i nevrovitenskap og neurofarmakologiforskning. Sameksistensen av glialceller og nevroner i CGN-kulturen kan imidlertid føre til forstyrrelser i den nøyaktige vurderingen av neuronal levedyktighet. Fluoresceindiacetat (FDA) og Propidium Iodide (PI) dobbeltfarging har blitt brukt til å måle celle-levedyktighet ved samtidig evaluering av levedyktige og døde celler. Vi brukte FDA-PI dobbeltfarging for å forbedre sensitiviteten til de kolorimetriske analysene og å evaluere neuronal levedyktighet i CGNs. Videre tilsatte vi blå fluorescerende DNA-flekker ( f.eks. Hoechst) for å forbedre nøyaktigheten. Denne protokollen beskriver hvordan man kan forbedre nøyaktigheten av vurderingen av neuronal levedyktighet ved å bruke disse metodene i CGN-kulturen. Ved hjelp av denne protokollen kan antall glialceller utelukkes ved bruk av fluorescensmikroskopi. En lignende strategi kan brukes for å skille mellom uønskede gliAlceller fra nevroner i forskjellige blandede cellekulturer, slik som primær kortikultur og hippocampalkultur.

Introduction

Klarimetriske cytotoksisitetsanalyser, slik som 3- (4, 5-dimetyl-2-tiazolyl) -2, 5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) -assayet, blir ofte brukt til å måle celle-levedyktighet in vitro . Primærkulturerte Cerebellar Granule Neurons (CGN) fra rotter er følsomme overfor forskjellige nevrotoksiner, inkludert 1-metyl-4-fenylpyridiniumion, hydrogenperoksid og glutamat 1,2. Derfor kan CGN-kulturer brukes som en in vitro- modell innen nevrovitenskap. CGN-kulturer kan inneholde en rekke celler, inkludert nevroner og glialceller, som kan utgjøre om lag 1% av de totale cellene i CGN-kulturen. Glialceller reagerer imidlertid annerledes på nevrotoksiner sammenlignet med nevroner, noe som fører til en forspenning i neuronal levedyktighet målt ved kolorimetriske analyser 3 .

I levedyktige celler kan fluoresceindiacetat (FDA) omdannes til fluorescein med esterase.Propidiumjodid (PI) kan samhandle med DNA etter å ha penetrert døde celler og kan brukes til å indikere apoptose i kulturen. Derfor kan FDA-PI-dobbeltfarging samtidig evaluere levedyktige celler og døde celler, noe som tyder på at cellens levedyktighet kan måles mer nøyaktig ved å kombinere begge kolorimetriske metoder. Videre, ved å legge til Hoechst, en blå fluorescerende flekk for kjerner, kunne nøyaktigheten av celle-levedyktighet ytterligere forbedres. Protokollen som presenteres her beskriver FDA-PI dobbeltfarging og FDA-PI-Hoechst triple-farging, som kan brukes til å nøyaktig analysere neuronal levedyktighet i primære dyrkede CGNs.

Denne protokollen benytter seg av å visualisere og skille mellom CGN og glialceller i forskjellige størrelser og former. Etter farging regnes antall levedyktige nevroner og døde nevroner fra representative bilder tatt av fluorescerende mikroskopi. De store glialcellene er ekskludert ved sammenligning av typiske CGNs tAken under fluorescerende modus med de som er tatt under fasekontrastmodus. En lignende strategi kan utføres for å måle neuronal levedyktighet i blandede cellekulturer som inneholder nevroner og glialceller, slik som primære kortikale kulturer og hippokampkulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer fulgte National Institutes of Health (NIH) Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr (NIH-publikasjoner nr. 80-23, revidert 1996) og ble godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk (IACUC) ved Ningbo University SYXK-2008-0110).

1. Fremstilling av løsninger og kulturmedier

Merk: Reagenser og lagre må fremstilles under sterile forhold. Steriliser ved filtrering ved å bruke et filter med en porestørrelse på 0,22 μm.

  1. Forbered Poly-L-Lysin (PLL) stamløsning ved å tilsette 5 mg PLL til 10 ml dobbeltdestillert vann (ddH20). Steriliser ved å filtrere. Aliquot og lagre PLL-stamopløsningen ved -20 ° C i flere måneder.
  2. Klargjør Krebs-buffer ved å tilsette 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH2P04, 2,6 g D-glukose og 5,94 g 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre til 100 ml DdH 2 </ Sub> O. Steriliser ved å filtrere. Oppbevar Krebs-bufferløsningen ved 4 ° C i opptil en måned.
  3. Forbered 3,82% Mg2S04-løsning ved å tilsette 3,82 g Mg2S04 til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Oppbevar Mg 2 SO 4 løsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  4. Klargjør 1,2% CaCl2-oppløsning ved å tilsette 1,2 g CaCl2 til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Oppbevar CaCl 2- oppløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  5. Klargjør 2M KCl-oppløsning ved å tilsette 15 g KCl til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Oppbevar KCl-oppløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  6. Klargjør D-glukose stamløsning ved å tilsette 1,8 g D-glukose til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Aliquot og lagre D-glukoseoppløsningen ved 4 ° C i opptil en måned.
  7. Forbered Cytosin P-D-Arabinofuranosid (Ara-C) bestandssoluttIon ved å tilsette 0,24 g Ara-C til 10 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Aliquot og lagre Ara-C stamløsning ved 4 ° C i flere måneder.
  8. Tilbered 250 ml dyrkningsmedium (for 25-30 pups) ved å bruke 25 ml føtalt bovint serum (FBS), 2,5 ml 100x glutamin, 2,78 ml 2M KCl-oppløsning og 2,5 ml 100x antibiotika i Basal Medium Eagle (BME) . Juster volumet til 250 ml og steriliser ved filtrering.
  9. Forbered 25K medium ved å bruke 2,5 ml 100x glutamin, 2,78 ml 2M KCl-oppløsning og 2,5 ml 100x antibiotika i BME. Juster volumet til 250 ml og steriliser ved filtrering.
  10. Forbered 5K medium ved å bruke 2,5 ml 100x glutamin og 2,5 ml 100X antibiotika i BME. Juster volumet til 250 ml og steriliser ved filtrering.
    MERK: Kulturmediet, 25K medium og 5K medium må være tilberedt på ny
  11. Forbered FDA stamløsning ved å tilsette 5 mg FDA til 1 ml aceton. Oppbevar FDA-stamløsningen ved 4 ° C for langtidsoppbevaring. </ Li>
  12. Forbered PI stamløsning ved å legge 1 mg PI til 1 ml ddH 2 O. Oppbevar PI stamløsning ved 4 ° C i flere måneder.
  13. Lag Hoechst stamløsning ved å legge 5 mg Hoechst 33342 til 1 ml ddH 2 O. Oppbevar Hoechst stamløsning ved 4 ° C i flere måneder.

2. Fremstilling av oppløsningsløsninger

MERK: Gjør dette 1 d før disseksjonen.

  1. Forbered disseksjonsoppløsningen ved å tilsette 15 ml Krebs buffer, 1,2 ml 3,82% Mg2SO4-oppløsning og 0,45 g bovint serumalbumin (BSA) til 150 ml ddH20. Juster pH til 7,4 ved bruk av NaOH.
  2. Merk 5 x 50 ml rør som følger: 1, 2, 3, 4 og 5.
  3. Legg 40 ml disseksjonsoppløsning i en 50 ml sprøyte med et filter. Filtrer 30 ml disseksjonsoppløsning i rør 1 og 2 ml hver til flere 35 mm cellekulturretter, som vil bli brukt til å behandle vev.
  4. Til TUbe 2, tilsett 12,5 mg trypsin i 50 ml disseksjonsoppløsning. Bland helt ved vortexing. Steriliser ved å filtrere.
  5. Til rør 3 tilsettes 1,2 mg DNAse I, 7,8 mg soyabønne trypsininhibitor og 150 ul 3,82% Mg2S04-løsning i 15 ml disseksjonsoppløsning. Bland helt ved vortexing. Steriliser ved å filtrere.
  6. Til rør 4, tilsett 5 ml av oppløsningen fra rør 3. Tilsett 10,5 ml disseksjonsoppløsning. Steriliser ved å filtrere.
  7. Til rør 5 tilsettes 100 μl 3,82% Mg2S04-løsning og 15 μl 1,2% CaCl2-oppløsning i 12,5 ml disseksjonsoppløsning. Bland helt ved vortexing. Steriliser ved å filtrere.
  8. Oppbevar alle rør ved 4 ° C før bruk.

3. Coating Cell Culture Plates

MERK: Gjør dette 1 d før disseksjonen.

  1. Tilsett 1 ml PLL stamløsning til 100 ml ddH20 (sluttkonsentrasjon: 5 μg / ml). Frakk plast6-brønns- eller 12-brønnscellekulturplater (2 ml pr. Brønn for 6-brønne cellekulturplater eller 1 ml pr. Brønn for 12 brønnscellekulturplater) ved tilsetning av 5 μg / ml poly-L-lysinoppløsning.
  2. Inkuber ved romtemperatur i 1 dag (eller ved 37 ° C i 2 timer). 1-2 timer før disseksjonen, fjern løsningen med en pipette. Vask en gang med ddH 2O og tørk i cellekulturdekselet.

4. Behandling av væv til 8-dagers Sprague-Dawley-rotter.

  1. Legg en 100 mm tallerken på isen. Dekapitér rottepuppene i parabolen ved hjelp av et par steriliserte saks.
  2. Sett saksene inn i foramen magnum og kutt de to sidene av skallen, fra ørene til øynene. Løft skallen med et par tapper. Sørg for at hele hjernen er i skallen. Isoler cerebellumet og sett det inn i ovennevnte 35 mm tallerken ved hjelp av et par tapper.
  3. Arbeid under et dissekeringsmikroskop. Fjern meninges og blodkar med to par tapper.
  4. Hakk vevene med et blad. Sett vevene i rør 1. Sentrifuge i 5 minutter ved RT og 1500 x g.
  5. Aspirer supernatanten. Lagre pelleten.
  6. Tilsett løsningen i rør 2 til pellet. Resuspenderes ved å riste forsiktig.
  7. Plasser røret i et 37 ° C vannbad i 15 minutter. Rist forsiktig hvert 3. minutt.
  8. Tilsett løsningen i rør 4 til denne løsningen. Rist og sentrifuger i 5 minutter ved RT og 1500 x g.
  9. Aspirer supernatanten. Lagre pelleten.
  10. Tilsett løsningen i rør 3 for å resuspendere pelleten.
  11. Klargjør to 15 ml rør. Plasser halvparten av cellene i hvert rør. Pipetter opp og ned 60-70x ved hjelp av en bomullsplugg Pasteur pipette for å homogenisere cellene.
  12. Tilsett 3 ml av oppløsningen i rør 5 til hvert 15 ml rør. La dem sitte ved romtemperatur i 10 minutter, og fjern deretter supernatanten forsiktig med en bomullsplugg Pasteur pipette. Plasser supernatanten i nye 15 ml rør og sentrifuger i 5 minutter ved romtemperatur og 1500 x g.
  13. ENSpirer supernatanten. Lagre pelleten.
  14. Tilsett kulturmedium i pelleten for å få en celletetthet på rundt 1,5 x 106 celler / ml (ca. 100 ml for 10 pupper).
  15. Sett cellene i kulturplater og dyrk dem i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.

5. Tilsetning av Ara-C og D-glukose under dyrking

  1. Etter 24 timer tilsettes Ara-C stammeoppløsning (10 μl / brønn for 12-brønds cellekulturplater eller 20 μl / brønn for 6 brønncellekulturplater, sluttkonsentrasjon: 1 mM) for å hemme veksten av glialceller.
  2. På dag 7 tilsettes 50 μl D-glukose stamopløsning per brønn for 12 brønncellekulturplater eller 100 μl per brønn for 6 brønncellekulturplater slik at sluttkonsentrasjonen er 1 mM.

6. FDA-PI Double Staining og FDA-PI-Hoechst Triple Staining i CGN Culture

  1. Forbered FDA-PI-arbeidsløsningen ved å tilsette 20 μL FDA-stamopløsning (Sluttkonsentrasjon: 10 μg / ml) og 50 μl PI stamløsning (sluttkonsentrasjon: 50 μg / ml) i 10 ml PBS. Bland ved vortexing og plasser dette på is.
    1. For FDA-PI-Hoechst-arbeidsløsningen, tilsett 20 μL FDA stamløsning (sluttkonsentrasjon: 10 μg / ml), 50 μl PI stamløsning (sluttkonsentrasjon: 50 μg / ml) og 10 μl Hoechst stamløsning (Sluttkonsentrasjon: 5 μg / ml) i 10 ml PBS. Bland ved vortexing og plasser dette på is.
      MERK: Ferdig tilbered FDA-PI arbeidsløsning og FDA-PI-Hoechst arbeidsløsning like før bruk.
  2. Ta cellekulturplaten ut av inkubatoren. Sett den på is.
  3. Aspirer kulturmediet og erstatt det med kaldt PBS.
    MERK: Byttet av løsningen må gjøres sakte og forsiktig. Unngå å berøre cellene med pipettespisser.
  4. Aspirer det kalde PBS og erstatt det med kald FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst arbeidsløsning (500 μl / viLl for 12-brønd cellekulturplater eller 1 ml / brønn for 6-brønne cellekulturplater). La på is i 5 min.
  5. Aspirer FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-arbeidsløsningen og tilsett kald PBS (100 μl / brønn for 12-brønds cellekulturplater eller 50 μl / brønn for 6-brønne cellekulturplater).
    MERK: Cellene må ikke tørke når de tar bilder.
  6. Ta bilder med fluorescerende mikroskopi. Bruk et eksitasjonsfilter med et passbånd på 450 - 490 nm. Oppdag fluorescensutslippene for henholdsvis FDA, PI og Hoechst ved henholdsvis 520, 620 og 460 nm. Under samme forhold, ta et bilde under normalt lys ved hjelp av fasekontrastmodusen av fluorescerende mikroskopi.
    MERK: Ta bilder innen 15 minutter etter FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-farging. Eksponeringstiden er 100-300 ms, og den analoge gevinsten er 2,8x.

7. Vurdering av neuronal levedyktighet

  1. For FDA-PI dobbeltfarging, overlegg bildene av cellene som oppdages etter filtreringVed forskjellige fluorescensfiltre ved å dra det FDA-positive laget på det PI-positive laget i en grafikkredigeringsprogramvare.
    1. Juster opaciteten til FDA-positivt lag ved å skrive inn "50%" i "Opacity" -feltet i "Layers" -panelet. Slå sammen to lag ved å klikke på "Flett synlig" -knappen i "Lag" -menyen. Still kontrasten på overleggsbildene ved å skrive "50" i "Kontrast" -feltet under "Bilde" | "Justeringer" | "Lysstyrke / kontrast." Kontroller at det ikke finnes noen FDA- og PI-dobbelt-positiv celle i overleggsbildene.
  2. For FDA-PI-Hoechst triple-farging, overlegg bildene av cellene som er oppdaget etter filtrering av forskjellige fluorescensfiltre, ved å dra det FDA-positive laget på det PI-positive laget i en grafikkredigeringsprogramvare. Juster opaciteten til FDA-positivt lag ved å skrive inn "50%" i feltet "Opacity" i "Lag & #34; panel.
    1. Slå sammen to lag ved å klikke på "Flett synlig" -knappen i "Lag" -menyen. Dra Hoechst-positivt lag på det fusjonerte laget. Juster opaciteten til Hoechst-positivlaget ved å skrive inn "50%" i "Opacity" -feltet på "Layers" -panelet. Slå sammen de to lagene ved å klikke på "Merge Visible" -knappen i "Layer" -menyen.
  3. Visuelt skille store, uregelmessige glialceller fra CGNs ved å sammenligne bildene tatt under fluorescerende modus med de som er tatt under fasekontrastmodus. - Celler med diametre tre ganger større enn CGNs betraktes som glialceller og bør utelukkes.
  4. Telle antall levedyktige nevroner og døde nevroner, henholdsvis, ved å bruke en celle-teller i et bildebehandlingsprogram ( f.eks. ImageJ) 4 .
    1. For FDA-PI dobbeltfarging merker du manuelt små FDA-positive celler somLevedyktige nevroner. Merk manuelt PI-positive celler som døde nevroner. For FDA-PI-Hoechst triple-farging merker du manuelt små FDA- og Hoechst-dobbelt-positive celler som levedyktige nevroner. Merk manuelt PI- og Hoechst-dobbelt-positive celler som døde nevroner.
  5. Beregn prosentandelen av neuronal levedyktighet ved å bruke følgende ligning:% av neuronal levedyktighet = [antall levedyktige nevroner / (antall døde neuroner + antall levedyktige nevroner)] x 100%. For hver brønn, velg fem tilfeldige felt og gjennomsnittlig prosentandelen av neuronal levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den dobbelte immunostaining av GAP43 (rød) og GFAP (grønn) ble brukt til å analysere formen av nevroner og glialceller, henholdsvis 2 , 5 . Både nevroner og glialceller er tilstede i CGN-kultur. GFAP-positive glialceller er store og uregelmessige i form, som angitt av pilene i bildene ( figur 1 ). Tradisjonelle analyser for celle vitalitet kan ikke skille glialceller fra nevroner når de brukes til å måle neuronal levedyktighet. Derfor kan FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging, som kan skille glialceller fra nevroner, være fordelaktig for den nøyaktige evalueringen av neuronal levedyktighet i CGN-kultur.

Lavkaliumutfordringen ble brukt til å indusere nevronedød i en CGN-kultur. De representative bildene viser CGN-kulturen utfordret med lavkaliummedium (5K), normalt medium (25K) eller origiNal-medium, som analysert ved FDA-PI-dobbeltfarging ( figur 2A ) eller FDA-PI-Hoechst triple-farging ( figur 2B ). Neuronal levedyktighet målt ved forskjellige metoder er presentert i Figur 3 (middel ± SEM). Celleevnen som ble målt ved FDA-PI-dobbeltfarging i kontrollgruppene 25K og 5K var henholdsvis 99,8 ± 4,2%, 98,2 ± 2,9% og 43,9 ± 8,6% ( Figur 3A ). Celleevnen som ble målt ved FDA-PI-Hoechst triple-farging i kontroll-, 25K- og 5K-gruppene var henholdsvis 99,8 ± 1,6%, 96,7 ± 4,4% og 48,3 ± 4,4% ( Figur 3B ). Celleevnen som ble målt ved MTT-analyse i kontroll-, 25K- og 5K-gruppene var henholdsvis 102,1 ± 3,9%, 96,5 ± 1,7% og 57,5 ​​± 5,7% ( Figur 3C ). Prosentandelene av laktisk dehydrogenase-frigivelse (LDH) i kontroll-, 25K- og 5K-gruppene var henholdsvis 100,0 ± 5,5%, 94,5 ± 11,2% og 202,1 ± 15,3% (henholdsvis 2 . MTT-analysen vurderer aktiviteten til NADPH-avhengig cellulær oksydoreduktase, som reflekterer antall levedyktige celler 2 . Denne metoden kunne imidlertid ikke skille glialceller fra nevroner når de ble brukt til å måle neuronal levedyktighet i CGN-kulturen. Ved bruk av FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging kunne antall glialceller bli ekskludert, og nevonal levedyktighet kunne nøyaktig måles. Videre var den nevrale levedyktigheten i 5K mediumbehandlede CGN målt ved FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-farging litt mindre enn den som ble målt ved MTT-analyse. Dette kan skyldes at de fleste glialceller som ikke var følsomme for 5K medium-indusert nevrotoksisitet, ble ekskludert ved FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-farging, men ikke ved MTT-analysen.

Figur 1
Figur 1: Både små neuroner og store, uregelmessige glialceller er tilstede i CGN-kultur. På dag 8 i vitr var CGNer dobbeltimmunfargede med henholdsvis GAP43 (rød) og GFAP (grønn) for nevroner og glialceller. Fasekontrastbildene viser cellens morfologi. Tradisjonelle analyser for celle vitalitet kan ikke skille glialceller fra nevroner når de brukes til å måle neuronal levedyktighet. Derfor kan FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging, som kan skille glialceller fra nevroner, være fordelaktig for den nøyaktige evalueringen av neuronal levedyktighet i CGN-kultur. Skalbjelke: 100 μm. Blå pil: typiske nevroner; Hvit pil: typiske glialceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
FDA-PI Double Staining og FDA-PI-Hoechst Triple Staining demonstrerer lavkalium-indusert neuronal død i CGN-kultur. På dag 8 i vitr , ble CGN kulturer byttet til 5K eller 25K medium. Mediet i kontrollkulturer ble ikke forandret. Etter 24 timers utfordring ble CGN-kulturer analysert ved ( A ) FDA-PI-dobbeltfarging eller ( B ) FDA-PI-Hoechst triple-farging. Skalbjelke = 100 μm. Pil: typiske glialceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Kvantifisering av neuronal levedyktighet i CGN-kultur. På dag 8 i vitr , ble CGN kulturer byttet til 5K eller 25K medium. Mediet i kontrollkulturenS ble ikke endret. Etter 24 timers utfordring ble celle-levedyktighet analysert ved ( A ) FDA-PI dobbeltfarging, ( B ) FDA-PI-Hoechst triple-farging og ( C ) MTT-analyse. ( D ) LDH-frigivelsen ble analysert ved LDH-analyse. Dataene uttrykkes som middel ± SEM. ** p <0,01 kontra kontroll (ANOVA, Tukey test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen ble modifisert fra prosedyrer som er blitt beskrevet tidligere 6 , 7 . Forskere har brukt tid på å redusere ikke-neuronal cellevekst ved å forbedre forholdene når de dyrker primære neuroner in vitro 8 . Imidlertid, selv med forbedrede kulturforhold, forblir noen glialceller. Videre er ikke-neuronale celler nødvendige i primære nevronkulturer fordi de bidrar til nevron vekst og modning 9 . I denne studien ble Ara-C brukt for å minimere veksten av glialceller, selv om det fortsatt var om en 1 - 5% tilstedeværelse av glialceller i CGN-kulturen. Dette problemet presenteres også i andre gruppers studier 10 . I CGN-kulturen er størrelsene og formerne av glialceller i stor grad forskjellig fra nevroner. Diameteren av CGN er ca. 10 μm, og modne CGN har rike prosesser som forbinder nevronene. HoweVer, diameteren av glialceller i kultur er relativt stor, ca 30-100 μm, så det er lett å skille glialceller fra nevroner i bilder. Derfor er en fordel med FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging å nøyaktig måle neuronal levedyktighet i primære nevronkulturer der ikke-neuronal cellevekst ikke forhindres av kulturteknikker.

Lavkaliuminducert apoptose i CGN-kulturer, med 25K mediumbehandlede celler som kontroll, representerer en utmerket modell for å studere nevronal apoptose. Mange grupper, inkludert vårt laboratorium, har brukt denne klassiske modellstudien til de underliggende apoptotiske mekanismene til nevroner 2 , 11 . Derfor ble denne modellen brukt til å indusere nevronedød. Konsentrasjonen av fargestoffer og varighet av farging anvendt i denne protokollen er blitt optimalisert. Lave konsentrasjoner av fargestoffer og kortvarige farger kan forårsake utilstrekkelig farging, noe som fører til den unøyaktige kuNting av døde nevroner. Høye konsentrasjoner av fargestoffer og lengre varighet av farging kan imidlertid videre fremkalle neuronal død og forårsake en bias ved estimering av celle-levedyktighet. Derfor bør bildene tas så snart som mulig etter at fargene er lagt til. I FDA-PI-dobbeltfargingsbildene er små FDA-positive celler markert som levedyktige nevroner. Celleorganer har imidlertid en tendens til å gruppere seg i CGN-kulturen. Derfor kan det være vanskelig å skille levedyktige celler ved FDA-farging. I denne studien ble Hoechst, en nukleær flekk, brukt til å forbedre nøyaktigheten. Små celler med FDA-positive cellekropper og Hoechst-positive kjerner kan betraktes som levedyktige nevroner i FDA-PI-Hoechst triple-fargeringsbilder.

Sammenlignet med kolorimetriske cytotoksisitetsanalyser, krever FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging mer tid for evaluering av neuronal levedyktighet i CGN-kultur. Derfor kan den nåværende protokollen ikke være egnet til å skjerme nevrobeskyttende stoffer. Men denne begrensningenKan løses ved å bruke et høyt innholds bildebehandlingssystem. En annen begrensning av denne teknikken er at CGN og glial ikke kan diskrimineres av PI. Men fordi nevroner er mer utsatt for nevrotoksiner enn glialceller, er PI-positive døde celler hovedsakelig nevroner 12 .

I tillegg til FDA, PI og Hoechst, brukes andre fargestoffer, som MTT, SYTO13 og SYBR14, også til å måle celleevnen 13 , 14 . For MTT-analysen kan glialceller som ikke er følsomme for nevrotoksiner, omdanne MTT til formazan, noe som fører til overestimering av neuronal levedyktighet. SYTO13 er celle-permeabel og har et høyt grønt fluorescerende utbytte når det er bundet til DNA eller RNA. En tidligere studie antydet at SYTO13-farging hovedsakelig indikerer apoptotiske celler i CGN-kultur, men skiller ikke glialceller fra nevroner 13 . SYBR14 er et membran-permanent nukleinsyrefargestoff. SYBR14-PI dobbeltfarging er ossEd for å måle celle-levedyktighet fordi begge farger merker DNA, og derved omgår tvetydigheten 14 . Imidlertid kan SYBR14-PI dobbeltfarging ikke effektivt skille glialceller fra nevroner i CGN-kultur. Derfor kan FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging, som kan skille glialceller fra nevroner, være fordelaktig for den nøyaktige evalueringen av neuronal levedyktighet i CGN-kultur.

Endelig er FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farging ikke begrenset til analysen av neuronal levedyktighet i CGN-kulturer. Mange blandede cellekulturer ( f.eks. Primære kortikale kulturer og primære hippocampale kulturer) inneholder også nevroner og glialceller. Derfor kan en lignende strategi påføres de blandede cellekulturer for nøyaktig å analysere neuronal levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Naturvitenskapsstiftelsen i Zhejiang-provinsen (LY15H310007), Applied Research Project on Nonprofit Technology of Zhejiang-provinsen (2016C37110), National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407), Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), Ningbo kommunale innovasjonsteam for livsvitenskap og helse (2015C110026), Guangdong Provincial Internasjonalt Samarbeidsprosjekt for Vitenskap og Teknologi (nr. 2013B051000038), Shenzhen Basic Research Program (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong Kong Technology Co-ordning Scheme (GHP / 012 / 16GD), Research Grants Council of Hong Kong (15101014), Hong Kong Polytechnic University (G-YBGQ) og KC Wong Magna Fund ved Ningbo University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

Neurovitenskap utgave 123 cerebellar granulæreuroner fluoresceindiacetat propidiumjodid cellelevbarhet glialceller fluorescensmikroskopi
Vurdering av neuronal levedyktighet ved bruk av fluoresceindiacetat-propidiumjodid-dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter