Анализ терминации транскрипции с помощью BrUTP прядей специфичную Транскрипция выбега (TRO) подход
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Эта рукопись описывает протокол для обнаружения терминации транскрипции дефекта в естественных условиях. Нить-специфический протокол TRO использованием BrUTP, описанный здесь мощный экспериментальный подход для анализа дефекта терминации транскрипции в физиологических условиях. Как и в традиционном анализе TRO, он опирается на наличие транскрипционно активного полимеразой за 3' – конца гена в качестве индикатора терминации транскрипции дефекта 1. Он преодолевает две основные проблемы, связанные с традиционным анализом TRO. Во-первых, он может обнаружить, если полимеразной чтение через сигнал завершения является тот, который инициировал транскрипцию с промотора проксимальных области, или если он просто представляя pervasively переписывание полимеразы, вызвавшее неспецифически откуда-то в теле или 3 ' конец гена. Во-вторых, он может различить, если транскрипционно активный сигнал полимеразной за пределытерминатор область поистине readthrough мРНК чувство транскрибировать полимеразы или некодирующей РНК сигнала несмысловая терминатор инициируемого. В кратком изложении, протокол включает в себя permeabilizing экспоненциально растущие клетки дрожжей, позволяя транскрипты , которые инициированы в естественных условиях , чтобы удлинить в присутствии нуклеотид BrUTP, очистив BrUTP-меченой РНК с помощью аффинной подход, обратный транскрибировать очищенный возникающую РНК и амплификации кДНК с использованием прядей-специфических праймеров , фланкирующих промотор и терминатор области гена 2.
Introduction
Эукариотической транскрипции цикл состоит из трех основных этапов; инициация, удлинение и прекращение. Терминации транскрипции с помощью РНК – полимеразы II состоит из двух различных, взаимозависимых шагов 3. Первый этап включает в себя расщепление, полиаденилирования и высвобождение мРНК из шаблона, и сразу же следует второй стадии, отмеченной разъединении полимеразы из шаблона. Надлежащее прекращение имеет решающее значение для рециркуляции полимеразы во время инициации / повторной инициации транскрипции, для предотвращения помех транскрипции генов вниз по течению, а также для поддержания аберрантную транскрипции в проверке путем ограничения транскрипции распространенным некодирующие РНК 4, 5. Несмотря на недавние успехи, прекращение на сегодняшний день является наименее изученной стадией цикла транскрипции РНК-полимеразы II. Надежный анализ прекращения имеет важное значение для изучения механизма по вкладуг прекращение транскрипции РНК – полимеразы II в естественных условиях.
Ряд экспериментальных подходов используются для обнаружения дефектов терминации в активно транскрибировать ген в физиологических условиях. К ним относятся блоттинга, фактор прекращения Обломок (иммунопреципитации хроматина) и традиционного TRO анализа. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Традиционный анализ TRO имел обыкновение быть самым надежным и чувствительным подходом для обнаружения дефекта терминации транскрипции в естественных условиях 1. Этот анализ локализует транскрипционно активных молекул-полимеразу на разных районах гена внутри клетки. В нормальных условиях, анализ показывает , транскрипционно молекулы полимеразы , заходят самые перспективные строго распределены между промотором и терминатором области гена (рис 1А). При неисправном прекращении, однако полимераза не может прочитать сигнал завершенияи обнаруживается в области ниже по потоку от 'конца гена (рис 1б) 3.
Дефект терминации транскрипции проявляется в присутствии чувственное транскрибировать полимеразы, инициировавшего из промотора проксимальных области, и будучи не в состоянии прочитать сигнал завершения, продолжает расшифровывать область вниз по течению от 3' – конца гена , как показано на рисунке 2A. С осознанием того, что эукариотический геном проявляет подавляющую распространяющееся транскрипцию в смысле, а также направления антисмысловые и вокруг гена 6, 7, 8, 9, 10, вскоре стало ясно , что традиционный анализ TRO не может обнаружить , если сигнал полимеразы вниз по течению гена представляет собой промотор инициированное транскрипт (фиг.2А) или аберрантных РНК, вызвавшее сомаewhere в середине гена или вниз по потоку от терминатора элемента (Фигура 2В) или полимеразной транскрибировать в направлении антисмысловой от 3' – конца гена (фиг.2с). Прядь конкретных TRO анализа с использованием BrUTP, описанный здесь можно выделить, если наблюдаемый сигнал readthrough полимераза представляет промотор инициированное мРНК обобщенно или антисмысловой транскрипт, который инициировал вниз по течению гена под экспертизой. Мы успешно использовали этот подход , чтобы продемонстрировать роль Kin28 киназы в терминации транскрипции в почкующихся дрожжей 2. Используя подход здесь мы покажем , что Rna14 требуется для прекращения транскрипции ASC1 в почкующихся дрожжей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нить-специфический протокол TRO , используемый здесь был адаптирован из протокола , используемого для анализа GRO-Seq (Global Run On-секвенирования) в клетках млекопитающих 12. Мы успешно изменили протокол для изучения формирующегося транскрипции в почкующихся дрожжей. Для того, чтоб…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Riferimenti
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al. The reality of pervasive transcription. PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
