3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法
Summary
Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Abstract
単層細胞培養物は十分に複雑な細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用に関与する組織のインビボ挙動をモデル化しません。三次元（3D）細胞培養技術は、接着細胞培養物の欠点に対処するために開発され、最近の技術革新です。 インビトロ組織類似体を生成するためのいくつかの技術が開発されてきたが、これらの方法を確立すること、高価、しばしば複雑であり、特殊な装置を必要とし、一般的にのみ、特定の細胞型との互換性により制限されます。ここでは、腫瘍の様々な成長と正常細胞株と互換性のある一貫したサイズの多3Dスフェロイドに細胞を集約するための迅速かつ柔軟なプロトコルを記述します。我々は、足場非依存性スフェロイドの生成を促進し、高度に再現可能な方法で細胞単層の形成を防止するために、血清およびメチルセルロース（MC）の種々の濃度を使用します。 INDIVのための最適条件idual細胞株はスフェロイド形成培地中MCまたは血清濃度を調整することによって達成することができます。生成された3Dスフェロイドは、細胞シグナル伝達または遺伝子発現研究、候補薬物のスクリーニング、またはそのような腫瘍細胞の浸潤および遊走などの細胞プロセスの研究に含めた幅広い用途での使用のために収集することができます。プロトコルはまた、容易に単一細胞からクローンスフェロイドを生成するように適合され、足場非依存性増殖およびアノイキス耐性を評価するために適合させることができます。全体として、我々のプロトコルは、組織の三次元微小環境を再現し、正常細胞および腫瘍細胞のインビボ増殖をモデル化するために、3D細胞スフェロイドを生成し、利用するための簡単に修正する方法を提供します。
Introduction
腫瘍細胞の挙動の生物学的に関連する評価は、これらが十分に生体内で見つかった細胞微小環境を反映していないため、部分的には、従来の2次元（2D）細胞培養法を用いて挑戦されています。培養物（ 例えば 、Boydenチャンバーアッセイ）に細胞外マトリックス成分を組み込んだ別のアプローチは、生体内の組織環境の複数の生理的に代表的なものです。しかしながら、それらは個々の細胞の挙動の評価に限定することができ、組織または腫瘍増殖1、2、3に寄与する細胞-マトリックス及び細胞-細胞間相互作用のインビボでの組み合わせで複合体を再現しません。
多細胞スフェロイドの使用は、より正確にin vivoでの細胞増殖1のコンパクトなアーキテクチャを再現最近のアプローチであります4。スフェロイドは、正常細胞の細胞-マトリックス相互作用を調査するために使用することができるだけでなく、転移性増殖または薬剤耐性4のように、腫瘍進行の特性をモデル化するために、腫瘍の類似体として作用することができます。
スフェロイドは、単一細胞クラスター（ 例えば 、懸滴、遠心分離法）6,7を形成するために、複数の細胞の凝集を促進することにより、より迅速マトリックス5内に埋め込まれた単一細胞の増殖により形成された、又はされてもよいです。既存の細胞凝集技術は、高価な材料や特殊な装置を必要とし得ます。加えて、これらのスフェロイドは、サイズ及び形態の広い範囲を有し、成長条件または困難な処置間の比較を行う、大量に製造することが困難であってもよいです。最後に、これらの方法によって生成されたスフェロイドは、タンパク質extracelから単離することは困難ですそれらは、他のアプリケーションで使用するために埋め込まれたlularマトリックス。
ここでは、市販のU底細胞撥プレートと不活性接着促進マトリックス、メチルセルロースを使用して、一貫サイズのスフェロイドの急速な形成のための堅牢かつ容易に修正細胞凝集方法を説明します。一旦形成されると、これらの多細胞スフェロイドを容易に広範囲の用途での使用のために単離されます。プロトコルはまた、容易に他の細胞プロセスを評価するために使用され得る細胞増殖を介してスフェロイドを生成するように適合されています。ここでは、これらの二つの異なる回転楕円体形成プロトコルのアプリケーション例として、免疫蛍光染色によって定量し、細胞浸潤アッセイ、およびアノイキスアッセイを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、安価で広く入手可能な試薬を用いたin vivo組織のアーキテクチャをモデル化するために、3Dスフェロイドを生産するための迅速かつ柔軟な方法を提示します。我々のプロトコルは、細胞凝集を媒介し、細胞単層の形成を最小限にするためにMC 8,9の非細胞毒性および接着促進特性を利用します。動物源から単離されたタンパク質ベー?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Materials
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
Riferimenti
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