ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש
Summary
Multiparameter פלואורסצנטי אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את המספר, הפצה יחסית, ולוקליזציה של אוכלוסיות תאים החיסון microenvironment הגידול. כתב היד מתאר את השימוש בטכניקה זו כדי לנתח תת-תאים של תאי T בסרטן הלוע.
Abstract
ארבעת צבעים אימונוהיסטוכימיה (IHC) הטכניקה היא שיטה לכמת אוכלוסיות תאים עניין תוך לקיחה בחשבון ההפצה היחסית שלהם לוקליזציה ברקמה. טכניקה זו יושמה בהרחבה כדי לחקור את החיסון החיסוני בסוגי הגידול השונים. Microenvironment הגידול הוא שחדר על ידי תאים החיסונית נמשכים לאתר הגידול. אוכלוסיות תאים חיסוניים שונים נמצאו לשחק תפקידים שונים microenvironment הגידול יש השפעה שונה על תוצאות המחלה. כתב יד זה מתאר את השימוש multifarameter פלואורסצנטי IHC על קרצינומה של תאי קשקש אורופרינגל (OPSCC) כדוגמה. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת דגימות רקמות אחרות סוגי תאים של עניין. במחקר המוצג, ניתחנו את תא intraepithelial ו stromal של קבוצה גדולה OPSCC (n = 162). התמקדנו בלימפוציטים מסוג T (CD3 + ), immunosuppressive regulatאו תאי T (Tregs, כלומר, FoxP3 + ) ו T עוזר 17 (תאים TH17) ( כלומר, IL + 17 + CD3 + ) באמצעות counterstain גרעיני להבחין אפיתל הגידול מ stroma. נמצא כי מספר גבוה של תאי T נמצא בקורלציה עם הישרדות משופרת ללא מחלה בחולים עם מספר נמוך של תאי IL-17 + שאינם תאי T. דבר זה מצביע על כך שתאי ה- IL-17 + T עשויים להיות מתואמים עם תגובה חיסונית ירודה ב- OPSCC, אשר עולה בקנה אחד עם המתאם המתואר בין IL-17 להישרדות ירודה בחולי סרטן. נכון לעכשיו, רומן multiparameter פלואורסצנטי IHC טכניקות מפותחים באמצעות עד 7 fluorochromes שונים יאפשר אפיון מדויק יותר לוקליזציה של תאים חיסוניים microenvironment הגידול.
Introduction
קרצינומה של תאי הקשקש (OPSCC) של תאי הקשקש (OPSCC) הם קבוצה הטרוגנית של סרטן תאי קשקש שמקורם ב- oopharynx. גורמי הסיכון של OPSCC כוללים זיהום פפילומארוס (HPV) אנושי ושימוש באלכוהול ובטבק 1 , 2 . תפקידה של התגובה החיסונית וכיצד להשתמש בה במסגרת קלינית הוא רק מתחיל להיות בחנו. Microenvironment הגידול הוא שחדר על ידי תאים החיסונית נמשכים לאתר הסרטן. למרות CD8 גבוה + T ציטוטוקסיים תאי תדר כבר מתואם עם הישרדות משופרת בחולי OPSCC 3, תפקידיו של תת תאי T אחרים, כוללים תאי Tregs ו TH17, עדיין לא ברורים 4. בעוד תאי Th1 ו- TH17 אמורים לסייע לתאי הגידול מיקוד התגובה החיסונית, Tregs ידועים ביכולות שלהם כדי לדכא את הפעילות של תאי T אחרים 5. עם זאת, נוכחותו של Tובתקנות כבר נמצאו בקורלציה היא בתגובות חיוביות ושליליות ב סוגי גידולים שונים 6. מאחר שלא כל תאי החיסון הנמצאים בדם חודרים לגידול באותה מידה, לימוד המיקרו-סביבה של הגידול המקומי מספק את המדד הכי אמין לתגובה החיסונית המכוונת כנגד הגידול. מטרת המחקר היא לקבוע את המתאם בין המספרים וסוגי תאי החיסון לבין התוצאה הקלינית. השתמשנו ארבע צבע פלואורסצנטי הדמיה IHC לנתח את מספר לוקליזציה של תת שונות subpopulations T OPSCC האדם.
התמקדנו בלימפוציטים מסוג T (CD3 + ), בתאי ה- TH17 וב- FoxP3 + טרגס החיסוני, אשר מסלול ההבחנה שלהם קשור קשר הדוק לתאי ה- TH17. תאי ה- TH17 מתאפיינים בשילוב של CD3 ו- IL-17. הציטוקין IL-17 יכול גם להיות מיוצר על ידי תאים שאינם T 7 . קבענו את ההתפלגות של intra-epitתאי tials, T17, ו- IL-17 + שאינם תאי T בסדרה גדולה של מקרים OPSCC ונותחו את המתאמים עם הישרדות המטופל. Multicolor פלואורסצנטי IHC שימש כדי לזהות את הביטוי של CD3, Foxp3, ו- IL-17, בשילוב עם Counterstain DAPI. Assay זה איפשר זיהוי קל וברור של שני תאים סרטניים (באמצעות מכתים גרעיני DAPI) ואוכלוסיות תאי T חדיר (באמצעות שילוב של סמנים שונים). בעקבות הכנת המדגם מכתים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוכנות הדמיה שימשו להפריד בין צבעים פלואורסצנטיים שונים המשמשים כדי לקבוע את מספר וסוג התאים הנוכחי הן אפיתל הגידול הגידול stroma הקשורים.
Assay חלופי לכמת פנוטיפ אוכלוסיות תאים החיסון הוא זרימת cytometry זרימה, או cytometry לפי זמן הטיסה (CyTOF) ניתוח, של דגימות הגידול או היקפי ( כלומר, דם או מיימת). באמצעות זהטכניקה, כל המידע על לוקליזציה והפצה יחסית של סוגי תאים שונים הולך לאיבוד. השימוש וניתוח של דגימות היקפי גם אינו מספק מידע על אילו תאים מסוגלים לחדור microenvironment הגידול. דם ו ASCite תאים חיסוניים ניתוחים הוכחו לא כדי לשקף את הפנוטיפ ואת התדירות של חיסון התא החיסונית של רקמת הגידול 8 , 9 .
חלופה נוספת היא השימוש במיקרוסקופ שדה בהיר. יתרון של טכניקה זו על הדמיה פלואורסצנטי הוא היעדר autofluorescence רקמות. למרות כמה דגימות להכיל יותר autofluorescence, במיוחד אריתרוציטים, אבל גם סוגי תאים אחרים, כולל גרנולוציטים נויטרופילי, אזורים אלה יכולים בקלות להסיר את הניתוח של כמעט כל הדגימות. Immunofluorescence מציעה את היתרון של ניתוח סמנים מרובים במדגם אחד באמצעות פאנל של fluoresce ממוקדאורכי גל. זה כרגע בלתי אפשרי באותה מידה עבור מיקרוסקופ שדה בהיר בשל היעדר מספר מספיק של תוויות ואיזוטופים נוגדן זמין מסחרית עבור אנטיגן מסוים.
טכניקת ה- IHC של הקרינה הרב-גונית המתוארת כאן שימשה בסוגי סרטן רבים ושילובים שונים של נוגדן כדי לחקור אוכלוסיות תאים חיסוניות שונות, כמו גם מולקולות של תאים המופיעים בתאים, כגון אנטיגנים של לויקוציטים אנושיים (HLA) ו- PD-L1 10 , 11 , 12 . הפרוטוקול הוקם ו תוקף באמצעות סוגים שונים של דגימות ונוגדנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור הפרוטוקול המתואר, אחד הצעדים הקריטיים ביותר היא לקבוע את הדילול הנכון של הנוגדנים העיקריים בשימוש. הדילול של נוגדנים משניים שכותרתו היה 1: 200, כפי שמומלץ על ידי היצרן של אלה נוגדנים ספציפיים שכותרתו Alexa. הדילול של הנוגדנים העיקריים צריך להיקבע על ידי דילול סדרתי, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
סימון פונט נתמכה על ידי הענקת UL2010-4801 מן האגודה ההולנדית לסרטן. ברצוננו להודות לכל המחברים השותפים של המאמר המקורי כי פרוטוקול זה מבוסס על: אמילי א. דרונקרס, מארי ג'יי.פי וולטרס, רנסקה גודמן, סנאדה קולנוביץ ', אליזבת בלומנה, פיטר ג'ף סנייגרס, ארקו גורט, וסוורד ואן בית Seating
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Riferimenti
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?. Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?. Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. . Essential Medical Statistics. , (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. . Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
