طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم
Summary
توفر هذه المقالة طريقة مفصلة لإجراء فحص الكيميائي العدلة السريع عن طريق دمج العزلة على رقاقة العدلات من الدم الكامل واختبار الكيميائي على رقاقة ميكروفلويديك واحدة.
Abstract
العدلات الهجرة و الكيميائي حاسمة لجهاز المناعة في الجسم. وتستخدم الأجهزة ميكروفلويديك على نحو متزايد للتحقيق الهجرة العدلات والكيماوية نظرا لمزاياها في التصور في الوقت الحقيقي، ومراقبة دقيقة لتوليد تركيز تركيز الكيميائية، وانخفاض كاشف واستهلاك العينة. في الآونة الأخيرة، وقد بذلت جهود متزايدة من قبل الباحثين ميكروفلويديك نحو تطوير متكاملة وسهلة التشغيل نظم تحليل الكيميائي ميكروفلويديك، مباشرة من الدم كله. في هذا الاتجاه، وقد تم تطوير أول طريقة على كل رقاقة لدمج تنقية سلبية المغناطيسي من العدلات والمقايسة الكيميائي من عينات حجم الدم الصغيرة. هذه الطريقة الجديدة تسمح السريعة عينة إلى نتيجة اختبار العدلات الكيميائي في 25 دقيقة. في هذه الورقة، ونحن نقدم مفصلة البناء والتشغيل وتحليل البيانات طريقة لهذا الفحص الكيميائي الكل على رقاقة مع مناقشة حول استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ييميوالتوجهات والاتجاهات المستقبلية. تظهر النتائج التمثيلية للاختبار الكيميائي العدلات اختبار كاشف كيميائي محدد، N -Formyl-ميت-ليو-ف (فملب)، والبلغم من مرض الانسداد الرئوي المزمن (كوبد)، وذلك باستخدام هذه الطريقة كل على رقاقة. هذا الأسلوب ينطبق على العديد من التحقيقات المتعلقة بالهجرة الخلية والتطبيقات السريرية.
Introduction
الكيميائي، وهي عملية موجهة للهجرة الخلية للذوبان التدرج الكيميائي التدرج، وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الاستجابة المناعية 1 ، 2 ، 3 ، تطوير الأنسجة 4 والسرطان الانبثاث 5 . العدلات هي مجموعة فرعية من خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتلعب أدوارا حاسمة في تمكين وظائف الدفاع المضيف الفطرية الجسم، وكذلك في الوساطة الاستجابات المناعية التكيفية 6 ، 7 . وقد تم تجهيز العدلات بآلات كيميائية عالية التنظيم تسمح لهذه الخلايا المناعية المتحركة بالاستجابة لكل من الممتصات الكيميائية المستمدة من الممرضات (على سبيل المثال فملب) والمشتقات الكيميائية المستمدة من المضيف (على سبيل المثال إنتيرليوكين 8) من خلال إيمشيموتاكسيس 8 . العدلات الهجرة والكيميائية توسط مختلف المشاكل الفسيولوجيةوالأمراض مثل الالتهابات والسرطانات 1 ، 9 . وبالتالي، فإن التقييم الدقيق للالعدلات الكيميائي يوفر قراءات وظيفية هامة لدراسة البيولوجيا العدلات والأمراض المرتبطة بها.
بالمقارنة مع المقايسات الكيميائي التقليدية المستخدمة على نطاق واسع (على سبيل المثال مقايسة ترانسويل 10 )، وأجهزة ميكروفلويديك تظهر وعدا كبيرا لتقييم الكمي للهجرة الخلية والكيماوية بسبب جيل التدرج الكيميائي تسيطر على وجه التحديد والتصغير 11 ، 12 ، 13 . على مدى العقدين الماضيين أو نحو ذلك، وقد وضعت مختلف الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الكيميائي من أنواع الخلايا البيولوجية المختلفة، وخاصة العدلات 11 . وقد كرس جهد كبير لتوصيف الهجرة العدلات في تشي معقد من الناحية المكانية التدرجات ميكال التي تم تكوينها في الأجهزة ميكروفلويديك 14 ، 15 . وقد وضعت استراتيجيات مثيرة للاهتمام أيضا لدراسة اتخاذ القرارات الاتجاهية عن طريق العدلات باستخدام الأجهزة ميكروفلويديك 16.Aside من البحوث الموجهة بيولوجيا، وقد تم تمديد تطبيقات الأجهزة ميكروفلويديك لاختبار العينات السريرية لتقييم المرض 17 ، 18 ، 19 . ومع ذلك، فإن استخدام العديد من الأجهزة ميكروفلويديك يقتصر على مختبرات البحوث المتخصصة ويتطلب العزلة العدلات مطولة من حجم كبير من عينات الدم. لذلك، كان هناك اتجاه متزايد لتطوير أجهزة ميكروفلويديك متكاملة للتحليل الكيميائي العدلات السريع مباشرة من قطرة من الدم الكامل 20 ، 21 ، 22 ،إف "> 23 ، 24 .
نحو هذا الاتجاه، تم تطوير طريقة كل على رقاقة أن يدمج تنقية العدلات السلبية المغناطيسية والمقايسة الكيميائي اللاحقة على جهاز ميكروفلويديك واحد 25 . هذه الطريقة على كل رقاقة لديه الميزات الجديدة التالية: 1) على النقيض من الاستراتيجيات السابقة على رقاقة أن عزل العدلات من الدم عن طريق الالتصاق الخلية القائمة على الالتصاق أو الخلية القائمة على حجم الترشيح 20 ، 22 ، هذه الطريقة الجديدة تسمح عالية النقاء، على رقاقة الفصل المغناطيسي من العدلات من كميات صغيرة من الدم كله، فضلا عن قياس الكيميائي على التحفيز الكيميائي. 2) هيكل لرسو السفن الخلية يساعد على محاذاة المواقف الأولية للعدلات قريبة من قناة التدرج الكيميائية ويسمح تحليل الكيميائي بسيط دون تتبع خلية واحدة. 3) دمج العزلة العدلات و تشيموتمحور الفحص على جهاز واحد ميكروفلويديك يسمح السريع تحليل عينة إلى نتيجة الكيميائي في 25 دقيقة عندما لا يكون هناك انقطاع بين الخطوات التجريبية.
توفر هذه الورقة بروتوكول مفصل لبناء وتشغيل وطريقة تحليل البيانات من هذا كله على رقاقة الفحص الكيميائي. وتظهر الورقة الاستخدام الفعال للطريقة المتقدمة لأداء الكيميائي العدلات عن طريق اختبار معروفة كيميائي المؤتلف المعروفة وعينات كيميائية معقدة من المرضى، تليها مناقشة حول استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والقيود والاتجاهات المستقبلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، تم وصف بروتوكول مفصل لعزل مباشرة العدلات من الدم الكامل تليها اختبار الكيميائي، وكلها على رقاقة ميكروفلويديك واحدة. هذا الأسلوب يوفر ميزات مفيدة في عملية سهلة، واختيار السلبية من العدلات عالية النقاء، سريع عينة إلى نتيجة اختبار الكيميائي، الكواشف ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا (نزيرك) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (سيهر). نشكر المعهد السريري للبحوث التطبيقية والتعليم في مستشفى فيكتوريا العام في وينيبيغ ومستشفى سيفين أوكس العام في وينيبيغ لإدارة العينات السريرية من البشر. نشكر الدكتور هاجيت بيريتز-سوروكا لمناقشة مفيدة حول استراتيجيات عملية الفحص. نشكر البروفيسور كارولين رن والدكتور شياو مينغ (كودي) تشن من جامعة واترلو لدعمهم السخي في عملية التصوير.
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
