रैपिड न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस के लिए एक ऑल-ऑन-चिप विधि रक्त के एक बूंद से सीधे विश्लेषण
Summary
यह आलेख पूरे रक्त से ऑन-चिप न्युट्रोफिल अलगाव को एकीकृत करके और एकल माइक्रोफ्लिडिक चिप पर कैमोटैक्सिस परीक्षण को एकीकृत करके तेजी से न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस परख की विस्तृत पद्धति प्रदान करता है।
Abstract
न्युट्रोफिल प्रवासन और केमोटाक्सिस हमारे शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण हैं। वास्तविक समय की विज़ुअलाइजेशन, रासायनिक एकाग्रता ढाल बनाने की सटीक नियंत्रण, और अभिकर्मक और नमूना खपत को कम करने के कारण माइक्रोफ्ल्यूइडिक डिवाइस का उपयोग न्युट्रोफिल प्रवासन और केमोटाक्सिस की जांच के लिए किया जाता है। हाल ही में, संपूर्ण रक्त से सीधे एकीकृत और आसानी से संचालित माइक्रोफ्लुइडिक केमोटाक्सिस विश्लेषण प्रणालियों को विकसित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक शोधकर्ताओं द्वारा एक बढ़ते प्रयास किए गए हैं। इस दिशा में, न्युट्रोफिल के चुंबकीय नकारात्मक शुद्धि और छोटे रक्त के नमूने नमूनों से कीमोटाक्सिस परख को एकीकृत करने के लिए पहली सर्व-पर-चिप विधि विकसित की गई थी। यह नई पद्धति 25 मिनट में तेजी से नमूना-टू-न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस परीक्षण की अनुमति देती है। इस पेपर में, हम इस ऑल-ऑन-चिप चीमोटेक्सिस परख के लिए विस्तृत निर्माण, संचालन और डेटा विश्लेषण पद्धति प्रदान करते हैं, जिसमें समस्या निवारण रणनीतियों, लिमिTations और भविष्य दिशाओं न्युट्रोफिल केमोतोक्सिस परख के प्रतिनिधि परिणाम इस सब-ऑन-चिप विधि का उपयोग करते हुए, एक परिभाषित chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (एफएमएलपी), और एक पुरानी अवरोधक फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी) रोग से थूक का परीक्षण कर रहे हैं। यह विधि कई सेल प्रवासन संबंधी जांच और नैदानिक अनुप्रयोगों पर लागू होती है।
Introduction
कोमोटेक्सिस, घुलनशील रासायनिक एकाग्रता ढाल के लिए निर्देशित सेल प्रवास की प्रक्रिया, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 , 2 , 3 , ऊतक विकास 4 और कैंसर मेटास्टेसिस 5 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में गंभीर रूप से शामिल है। न्युट्रोफिल सबसे प्रचलित सफेद रक्त कोशिका सबसेट हैं और शरीर की सहज मेजबान रक्षा कार्यों को सक्षम करने के साथ ही अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 6 , 7 की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। न्युट्रोफिल उच्च-विनियमित केमोटेक्टिक मशीनरी से लैस हैं जो इन गतिशील प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रोगजनक व्युत्पन्न केमोटाटेन्टेंट्स ( जैसे एफएमएलपी) और मेजबान-व्युत्पन्न केमोटाटेन्टेंट्स ( जैसे इंटरल्यूकेन -8) के माध्यम से 8 के माध्यम से दिये गये हैं। न्यूट्रोफिल प्रवासन और केमोटाक्सिस विभिन्न शारीरिक समस्याओं में मध्यस्थता हैऔर रोग जैसे कि सूजन और कैंसर 1 , 9 इस प्रकार, न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस का सटीक आकलन न्युट्रोफिल जीव विज्ञान और संबंधित रोगों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक पढ़ाता है।
व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले परंपरागत केमोटेक्सिस एल्स ( जैसे ट्रान्सवेल परख 10 ) की तुलना में, माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस सटीक नियंत्रित रासायनिक ढाल पीढ़ी और लघुरूप 11 , 12 , 13 के कारण सेल प्रवासन और केमोटाक्सिस के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए महान वादा दिखाते हैं। पिछले दो दशकों में या तो, विभिन्न जैविक कोशिका प्रकारों, खासकर न्युट्रोफिल 11 के केमोटाक्सिस के अध्ययन के लिए विभिन्न माइक्रोफ़्लुइड उपकरणों का विकास किया गया है। महत्वपूर्ण प्रयास स्टेटियोमोरॉर्पोरेटिकल जटिलता में न्युट्रोफिल प्रवासन को दर्शाने के लिए समर्पित था माइक्रॉफ़्लुइडिक उपकरणों 14 , 15 में कॉन्फ़िगर किए गए मैजिक ग्रेडियेंट। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके न्युट्रोफिल द्वारा दिशानिर्देशित फैसले का अध्ययन करने के लिए दिलचस्प रणनीतियां भी विकसित की गईं। जैविक रूप से उन्मुख अनुसंधान के अलावा, माइक्रोवेसिफाईडिक डिवाइस के अनुप्रयोगों को 17 , 18 , 1 9 के रोग मूल्यांकन के लिए नैदानिक नमूनों का परीक्षण करने के लिए बढ़ा दिया गया है। हालांकि, कई माइक्रोफ़्लुइडिक उपकरणों का उपयोग विशेष शोध प्रयोगशालाओं तक सीमित है और रक्त के नमूनों की बड़ी मात्रा से लम्बी न्यूट्रोफिल अलगाव की आवश्यकता है। इसलिए, पूरे रक्त 20 , 21 , 22 की एक बूंद से सीधे न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस विश्लेषण के लिए एकीकृत माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस विकसित करने की बढ़ती प्रवृत्ति रही है ,Ef "> 23 , 24
इस दिशा में, एक ऑल-ऑन-चिप विधि विकसित की गई थी जो कि एक एकल माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस 25 पर चुंबकीय नकारात्मक न्यूट्रॉफ़िल शुद्धि और बाद में कीमोटाक्सिस परख को एकीकृत करता है। यह सब-ऑन-चिप विधि में निम्नलिखित उपन्यास विशेषताएं हैं: 1) पिछले ऑन-चिप रणनीतियों के विपरीत जो आसंजन-आधारित सेल कैप्चर या सेल आकार-आधारित फ़िल्टरिंग 20 , 22 द्वारा रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग करती है, इस नई विधि में उच्च परमिट होता है शुद्धता, पूरे रक्त के छोटे संस्करणों से neutrophils के चुंबकीय पृथक्करण के साथ ही chemoattractant उत्तेजना पर केमोटाक्सिस माप; 2) सेल डॉकिंग संरचना रासायनिक ढाल चैनल के निकट न्युट्रोफिल की प्रारंभिक स्थितियों को संरेखित करने में मदद करती है और एकल सेल ट्रैकिंग के बिना सामान्य केमोटेक्सिस विश्लेषण परमिट देती है; 3) न्युट्रोफिल अलगाव और केमोट का एकीकरणएकल माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस पर अक्ष का परख 25 मिनट में तेजी से नमूना-से-परिणाम केमोटाक्सिस विश्लेषण परमिट करता है जब प्रयोगात्मक कदमों के बीच कोई रुकावट नहीं होती है।
यह अख़बार इस सब-ऑन-चिप चीमोटाक्सिस परख के निर्माण, संचालन और डेटा विश्लेषण पद्धति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह पेपर न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस के लिए रोगी से एक ज्ञात पुनः संयोजक केमोएट्रेटेंटेंट और जटिल रसायनयुक्त नमूने का परीक्षण करके विकसित विधि के प्रभावी उपयोग को दर्शाता है, जिसके बाद समस्या निवारण रणनीतियों, सीमाओं और भविष्य के दिशा-निर्देशों पर चर्चा की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल को सीधे न्युट्रोफिल को संपूर्ण रक्त से अलग कर दिया गया है, जो कि कैमॉटोक्सिस टेस्ट के बाद किया गया था, जो कि एक एकल माइक्रोफ्लूइडिक चिप पर था। यह विधि अपने आसान संचालन, उ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम भाग में प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर) से अनुदान द्वारा समर्थित है। हम मानव विषयों से नैदानिक नमूनों के प्रबंधन के लिए विन्निपेग में विक्टोरिया जनरल अस्पताल और विन्निपेग में सात ओक्स जनरल अस्पताल में क्लिनिकल इंस्टीट्यूट ऑफ एप्लाइड रिसर्च एंड एजुकेशन का धन्यवाद करते हैं। हम परख अभियान रणनीतियों के बारे में उपयोगी चर्चा के लिए डॉ। हेजिट पेरेत्ज़-सोरोका का धन्यवाद करते हैं। फिल्मांकन प्रक्रिया में उनके उदार सहयोग के लिए हम वाटरलू विश्वविद्यालय से प्रोफेसर कैरोलिन रेन और डा। ज़ियाओमिंग (कोडी) चेन का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Device fabrication | |||
| Mask aligner | ABM | N/A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Digital scale | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
| Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
| isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
| Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
| Name | Source | Catalog Number | Comments |
| On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
| Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
| Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
| Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
| CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |
Riferimenti
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -. H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient’s sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
