Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak
Summary
Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kanser, kök hücre kaynaklı bir hastalıktır ve bu hücrelerin ortadan kaldırılması önemli bir terapötik hedeftir. Kanser Kök Hücrelerinin (CSC) zayıf yönlerinin çözülmesi ve uygun moleküler hedeflerin belirlenmesi, hücre çizgileri ve ex vivo tümör dokusu gibi heterojen örneklerde spesifik ayrımcılığa izin veren yöntemlere dayanmaktadır. Akış sitometrisi / FACS, tek hücreli seviyede biyolojik numuneleri çok parametrik olarak incelemek için güçlü bir teknolojidir ve aşağı akım analizleri için canlı hücrelerin geri kazanılması için seçilen yöntemdir. CD44 ve CD133 gibi yüzey markörlerinin yanı sıra aldehit dehidrogenaz enzimatik aktivitesinin saptanması, FACS tarafından tümör numunelerinden CSC'lerin tanımlanması ve sınıflandırılması için sıklıkla kullanılmaktadır. Metodolojik detaylarda burada açıklanan tamamlayıcı bir yaklaşım, genellikle yan popülasyon (SP) olarak adlandırılan farklı floresan-dim hücrelerinin bir popülasyonunu tanımlayan ABC ilaç taşıyıcıları ile fonksiyonel boya ekstrüzyonunu kullanmaktadır. SPKanser hücreleri kanonik kök hücre özellikleri sergiler ve boya ekstrüzyon ilaç taşıyıcısını (en sık ABCBl / P-glikoprotein / MDR1 / CD243 ve ABCG2 / Bcrp1 / CD338) inhibe eden ajanlar kullanılarak yok edilebilir ve işlevsel olarak teyit edilebilir. Üstelik SP testi, yüzey antijenlerinin boyanması, aldehid dehidrogenaz tespiti ve ölü hücre ayrımcılığı ( örneğin , 7-AAD veya propidyum iyodür (PI)) gibi diğer akış sitometrik değerlendirmeleriyle uyumludur. Bu nedenle, mekanik olarak fenotipik bir parametreden ziyade işlevsel olan CSC tanımlama, izolasyon ve alt karakterizasyon için değerli ve geniş bir şekilde uygulanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Başlangıçta tetikleyici boya olarak Hoechst 33342 ile yapılmış olsa da, burada, mor renkli bir lazer kaynağı ile donatılmış herhangi bir akış sitometresinde çözülebilen daha yeni olan Violet boya dayalı SP fenotipine odaklanırız.
Introduction
Primer kanser terapilerinin etkinliği, hastalığın genetik ve moleküler anlayışındaki gelişen ilerlemeler ve terapötik antikorlar ve küçük molekül inhibitörleri gibi hedefli ilaçların ortaya çıkması nedeniyle son on yılda önemli ölçüde iyileşmiştir. Aksine, metastatik ve tekrarlayan hastalık halen tedavi edilemez durumdadır ve morbidite ve mortalite bu klinik ortamlarda yüksek kalmaya devam etmektedir. CSC'ler tümörler içinde ayrı bir alt popülasyonu temsil eder ve klonojenisite / tümöre özdeşlik, çoklu ilaç direnci ve asimetrik hücre bölünmesi 1 , 2 gibi kanonik kök hücre özellikleri ile donatılırlar. Böylelikle, KKSler metastatik ilerlemeyi ve tümör heterojenliğini yönlendirmekle kalmaz aynı zamanda hastayı nüksetmeye yatkınlaştırmak için tedavi sırasında da devam eder. Terapötik CSC eliminasyonu, hastalık tekrarını önlemek ve kanserin uzun süreli iyileşmesine izin vermek için önemli tıbbi bir ihtiyaçtır 3 </sup>.
Koruma açığının tanımlanması ve CSC'lerin ortadan kaldırılması için stratejilerin aydınlatılması, sonraki ekspresyon profillemesi ve / veya fonksiyonel inceleme için biyolojik numunelerden arındırılmalarına izin veren yöntemlere bağlıdır. Bunun gibi yöntemler, bu hücrelere özgü yüzey, hücre içi veya işlevsel belirteçlere dayanır. CSC'ye spesifik yüzey işaretleyiciler arasında CD44, CD133, CD24 ve CD90 bulunur ve bunlarla sınırlı olmamak üzere meme kanseri ve kolon kanseri de dahil olmak üzere çeşitli tümör varlıklarındaki CSC popülasyonlarını tanımlamak için kullanılırlar. Bir başka markör olan aldehit dehidrogenaz (ALDH), hücre içi lokalizasyonu gösterir ve enzimatik dönüşümü ışık üreten ilgili bir substrat sağlayarak fonksiyonel olarak tespit edilebilir. Bu testi kullanarak CSC popülasyonları çeşitli tümör varlıklarında da tespit edilmiştir 5 . Tamamlayıcı bir yöntem, genelde SP analizi olarak anılır ve burada m olarak tasvir edilir. Etodolojik detay, 6 , 7 , 8 floresan-loş gövde benzeri hücrelerin küçük popülasyonlarını tanımlamak için ABC ilaç taşıyıcıları tarafından aktif boya akışı kullanmaktadır. Bunu sağlamak için belirli bir numune, pasif difüzyon yoluyla tüm hücrelere giren ve bağlanma için nükleer ve mitokondriyal DNA'yı hedefleyen bir lipofilik DNA bağlama floroforunun mevcudiyetinde inkübe edilir. ABC ilâç taşıyıcısı ifadesi bulunmayan CSC'ler boya biriktirerek parlak floresans oluştururken, CSC aktif olarak flüoresansı düşüren boyayı sıkıştırır. İlaç taşıyıcı aktivitesinin farmakolojik olarak inhibisyonu, SP fenotipini ortadan kaldırır ve işlevsel olarak teyit eder ve kontrol amaçlı kullanılmalıdır. SP özelliklerini sergileyen CSC popülasyonları diğerlerinin yanı sıra yumurtalık kanseri 9 , 10 , prostat kanseri 11 ,> 12, meme kanseri 13 , akciğer kanseri 14 , endometriyal kanser 15 , gliom 16 , 17 ve kemik sarkomu 18 . Önemli bir şekilde, spesifik bir tümör hücresi ayrımcılık stratejisi (bazı konakçı hücre popülasyonları da SP özellikleri sergileyebilir) gibi birincil materyal ilave zorluklar ortaya koymasına rağmen, SP testi hem kanser hücre hatları hem de primer tümör dokusu ile uyumludur .
En çok bilinen iki SP taşıyıcı ilaç taşıyıcısı ABCBl / P-glikoprotein / MDRl / CD243 ve ABCG2 / Bcrpl / CD338 8,9,21; Bununla birlikte, diğer ilaç taşıyıcıları SP fenotipinin de bir moleküler belirleyicisi olabilir ( örn. , ABCB5) 22 . ABCB1Verapamil ile etkin bir şekilde bloke edilebilirken, ABCG2'nin aktivitesi fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 ile özel olarak kaldırılabilir. SP analizinin belirli bir gücü, diğer lekelenmelerle ( örneğin , yüzey markörleri ve ALDH) birlikte kullanılabilmesi ve canlı hücre geri kazanımının, bu nedenle aşağı akışlı fonksiyonel araştırmalarla uyumlu olmasını sağlamasıdır. Dahası, SP algılama CSC popülasyonları 9 , 23 arasında ABC ilaç taşıyıcılarının yüksek korunması nedeniyle genel olarak uygulanabilir.
Başlangıçta, SP algılama, tetikleyici bir boya 24 olarak Hoechst 33342 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu boya mükemmel bir çözünürlük sağlar, ancak ultraviyole lazer uyarımını gerektirir; Dolayısıyla uygulanabilirliği doğal olarak ileri teknoloji akış sitometri aletleri ile sınırlıdır. DyeCycle Violet (DCV) 25'in ortaya çıkışı yeni avenu açtı.Sp analizleri için geliştirilmiş ve ultraviyole lazer kaynağı olmayan standart akış sitometrik enstrümanlarına (DCV-SP hücrelerini çözmek için mor bir lazer kaynağı yeterlidir) uygulanabilirliğini genişletmiştir. Önemlisi, Hoechst 33342 ve DCV, ortak pompa özgüllüklerini paylaşır, bu da boyanın aynı hücre popülasyonlarını tanımlaması gerektiğini gösterir.
Burada, bağımsız laboratuvarlarda hızlı ve kolay üreme için DCV'ye dayalı SP analizinin ayrıntılı bir deneysel protokolünü sunuyoruz. Yazıyı, bu yararlı hücre biyolojik yönteminin optimizasyonuna ve standardizasyonuna katkıda bulunması gereken CSC araştırmacıları için bir kaynak olarak algılıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanserin klinik yönetimindeki ilerleme, CSC'leri hedef alan tedavi yöntemlerinin gelişimine bağlıdır. CSC'lerin biyolojik numunelerden güvenilir şekilde izole edilmesine izin veren yöntemler, uygun hedeflerin belirlenmesini hızlandıracak ve bu nedenle bu çabanın kritik önemi altındadır. SP analizi, ABC ilaç taşıyıcılarını ifade eden CSC popülasyonlarını tanımlamak için kurulmuş ve değerli bir tekniktir ve DCV'nin uygulanması, standart akış sitometrik araçlarına uygulanabili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch, Avusturya Bilim Fonu FWF (hibe numarası J-3807) bir Erwin Schrödinger Kardeşliği tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
Riferimenti
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose?. Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
