Использование фенотипированного бокового популяционного фенотипа ДНК для обнаружения и очистки раковых стволовых клеток от биологических образцов
Summary
Методы, позволяющие характеризовать и изолировать популяции стволовых клеток из биологических образцов, имеют решающее значение для продвижения направленного на стволовые клетки лечения рака и других заболеваний. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции раковых стволовых клеток, используя фенотип побочной популяции, вызванный красителем.
Abstract
Рак – это заболевание, вызванное стволовыми клетками, и ликвидация этих клеток стала основной терапевтической целью. Расшифровка уязвимостей раковых стволовых клеток (CSC) и определение подходящих молекулярных мишеней основывается на методах, которые позволяют их специфическую дискриминацию в гетерогенных образцах, таких как клеточные линии и ex vivo опухолевые ткани. Проточная цитометрия / FACS – это мощная технология для многопараметрического рассечения биологических образцов на уровне отдельных клеток и на сегодняшний день является методом выбора для восстановления живых клеток для последующего анализа. Маркеры поверхности, такие как CD44 и CD133, а также определение ферментативной активности альдегиддегидрогеназы часто использовались для определения и сортировки CSCs из образцов опухолей с помощью FACS. Дополнительный подход, описанный здесь в методологических деталях, использует функциональную экструзию красителя транспортерами АВС-лекарств, которая идентифицирует отличную популяцию флуоресцентно-тусклых клеток, обычно называемую боковой популяцией (SP). SPРаковые клетки проявляют канонические характеристики стволовых клеток и могут быть аннулированы и функционально подтверждены с использованием агентов, которые ингибируют экструдирующий краситель экстракт транспортера (чаще всего ABCB1 / P-гликопротеин / MDR1 / CD243 и ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Кроме того, SP-анализ совместим с другими проточно-цитометрическими оценками, такими как окрашивание поверхностных антигенов, детекция альдегиддегидрогеназы и различение мертвых клеток ( например , с 7-AAD или иодидом пропидия (PI)). Таким образом, мы описываем ценный и широко применимый метод для идентификации, изоляции и подхарактеристики CSC, механически основанный на функциональном, а не фенотипическом параметре. Несмотря на то, что первоначально Hoechst 33342 был первоначально использован в качестве триггерного красителя, здесь мы сосредоточимся на более позднем фенотипе SP, основанном на фиолетовом красителе, который может быть разрешен на любом проточном цитометре, оснащенном источником фиолетового лазера.
Introduction
Эффективность первичной онкологической терапии значительно улучшилась за последнее десятилетие благодаря убедительным достижениям в генетическом и молекулярном понимании заболевания и появлению целевых лекарств, таких как терапевтические антитела и ингибиторы малых молекул. Напротив, метастатическая и рецидивирующая заболеваемость по-прежнему обычно неизлечима, а заболеваемость и смертность остаются высокими в этих клинических условиях. CSC представляют четкую субпопуляцию в опухолях и наделены каноническими свойствами стволовых клеток, такими как клоногенность / туморогенность, множественная лекарственная устойчивость и ассиметричное деление клеток 1 , 2 . Таким образом, CSC не только приводят к метастатическому прогрессированию и гетерогенности опухолей, но также сохраняются во время лечения, чтобы предрасположить пациента к рецидиву. Таким образом, терапевтическое удаление CSC является важной медицинской необходимостью для предотвращения рецидива заболевания и долгосрочного лечения рака 3 </suр>.
Идентификация уязвимостей и выяснение стратегий по искоренению CSC сильно зависит от методов, которые позволяют их очищать от биологических образцов для последующего профилирования экспрессии и / или функционального исследования. В свою очередь, такие методы опираются на поверхностные, внутриклеточные или функциональные маркеры, которые являются специфическими для этих клеток. CSC-специфичные поверхностные маркеры включают, но не ограничиваются ими, CD44, CD133, CD24 и CD90 и использовались для идентификации популяций CSC в различных опухолевых образованиях, включая рак молочной железы и рак толстой кишки 4 . Другой маркер, альдегиддегидрогеназа (ALDH), показывает внутриклеточную локализацию и может быть функционально обнаружен, обеспечивая соответствующий субстрат, ферментативное превращение которого вызывает свет. Используя этот тест, популяции CSC были идентифицированы также в разнообразных опухолевых сущностях. 5 . Дополнительный метод, обычно называемый анализом SP и представленный здесь в m Этодологическая деталь, улавливает активный отток красителя транспортерами АВС-препаратов для выявления небольших популяций флуоресцентно-тучных стволоподобных клеток 6 , 7 , 8 . Чтобы достичь этого, данный образец инкубируют в присутствии липофильного ДНК-связывающего флуорофора, который поступает во все клетки через пассивную диффузию и направляет ядерную и митохондриальную ДНК на связывание. Не-CSC, лишенные экспрессии транспортера лекарственного препарата ABC, аккумулируют краситель, приводящий к яркой флуоресценции, тогда как CSC активно экструдируют краситель, который уменьшает флуоресценцию. Фармакологическое ингибирование активности переносчика лекарственных средств отменяет и функционально подтверждает фенотип SP и должно использоваться для контроля. Группы CSC, проявляющие характеристики SP, были описаны, среди прочих, при раке яичников 9 , 10 , раке предстательной железы 11 ,> 12, рак молочной железы 13 , рак легкого 14 , рак эндометрия 15 , глиома 16 , 17 и костная саркома 18 . Важно отметить, что анализ SP совместим как с раковыми клеточными линиями, так и с первичной опухолевой тканью, хотя первичный материал создает дополнительные проблемы, такие как потребность в конкретной стратегии дискриминации опухолевых клеток (некоторые популяции клеток-хозяев также могут проявлять характеристики СП) 19 , 20 ,
Двумя наиболее известными SP-переносчиками наркотиков являются ABCB1 / P-гликопротеин / MDR1 / CD243 и ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Однако другие переносчики лекарственных средств могут также быть молекулярным детерминантом фенотипа SP ( например , ABCB5) 22 . ABCB1Может эффективно блокироваться верапамилом, тогда как активность ABCG2 может быть специально аннулирована фумитремонгином C (FTC) 6 , 19 . Особая сила SP-анализа заключается в том, что он может сочетаться с другими окрашиваниями ( например , поверхностными маркерами и ALDH) и что он позволяет восстановление живой клетки, таким образом, совместимым с последующими функциональными исследованиями. Более того, обнаружение SP широко применимо из-за высокой консервации транспортеров ЛСД среди популяций CSC 9 , 23 .
Первоначально детектирование SP было выполнено с использованием Hoechst 33342 в качестве триггерного красителя 24 . Этот краситель достигает превосходного разрешения, но требует возбуждения ультрафиолетовым лазером; Поэтому его применимость, естественно, ограничивается высокоточными проточными цитометрическими приборами. Появление DyeCycle Violet (DCV) 25 открыло новый авенюДля анализа SP и расширил применимость этого метода к стандартным проточным цитометрическим приборам, не имеющим источника ультрафиолетового лазера (источника фиолетового лазера достаточно для разрешения клеток DCV-SP). Важно отметить, что Hoechst 33342 и DCV обладают общими характеристиками насоса, указывая, что либо краситель должен идентифицировать одни и те же популяции клеток.
Здесь мы предоставляем подробный экспериментальный протокол анализа на основе DCV для быстрого и легкого воспроизведения в независимых лабораториях. Таким образом, мы воспринимаем нашу статью как ресурс для исследователей CSC, который должен способствовать оптимизации и стандартизации этого полезного клеточно-биологического метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прогресс в клиническом лечении рака также зависит от развития методов лечения, ориентированных на CSC. Методы, позволяющие надежно изолировать CSC от биологических образцов, ускорят идентификацию подходящих целей и, следовательно, имеют решающее значение в этом начинании. SP-анализ предс…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Максимилиана Боэша поддерживает Erwin Schrödinger Fellowship из Австрийского фонда науки FWF (грант номер J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
Riferimenti
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose?. Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
