Udnyttelse af DNA-farve-udløst sidebefolkningens fenotype til at detektere og rense kræftstamceller fra biologiske prøver

Summary

Metoder, der muliggør karakterisering og isolering af stamcellepopulationer fra biologiske prøver, er kritiske for fremskridtet af stamcelle-målrettede behandlinger i kræft og videre. Her tilvejebringer vi en detaljeret protokol for kræft stamcelle isolation ved hjælp af den farve-udløst side befolkning fænotype.

Abstract

Kræft er en stamcelledrevet sygdom, og udryddelse af disse celler er blevet et stort terapeutisk mål. Dekryptere sårbarheder af kræftstamceller (CSC'er) og identificering af egnede molekylære mål er baseret på metoder, der tillader deres specifikke diskrimination i heterogene prøver, såsom cellelinier og ex vivo tumorvæv. Flowcytometri / FACS er en kraftfuld teknologi til multiparametrisk dissektering af biologiske prøver på enkeltcelleniveau, og til dato er den valgte metode til at genoprette levende celler til downstream-analyser. Overflademarkører som CD44 og CD133 samt påvisning af aldehyddehydrogenase-enzymatisk aktivitet er ofte blevet anvendt til at definere og sortere CSC'er fra tumorprøver af FACS. En komplementær tilgang, der er afbildet her i metodologiske detaljer, gør brug af funktionel farvestofekstrudering af ABC-lægemiddeltransportører, som identificerer en tydelig population af fluorescensdimceller, der almindeligvis betegnes som sidepopulation (SP). SPCancerceller udviser kanoniske stamcelleegenskaber og kan ophæves og funktionelt bekræftes ved anvendelse af midler, der hæmmer farvestrålende ekstruderende lægemiddeltransportør (oftest ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 og ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Desuden er SP-assayet kompatibelt med andre flowcytometriske evalueringer, såsom farvning af overfladeantigener, aldehyddehydrogenase-detektion og dødcelleforskelsbehandling ( f.eks . Med 7-AAD eller propidiumiodid (PI)). Således beskriver vi en værdifuld og bredt anvendelig metode til CSC-identifikation, isolering og underkarakterisering mekanisk baseret på en funktionel, snarere end en fænotypisk parameter. Selvom det oprindeligt blev udført med Hoechst 33342 som udløsende farvestof, fokuserer vi her på den nyere Violet-farvestofbaserede SP-fænotype, der kan løses på ethvert flowcytometer udstyret med en violet laser kilde.

Introduction

Virkningen af ​​primære kræftterapier er forbedret væsentligt i løbet af det sidste årti på grund af overbevisende fremskridt inden for den genetiske og molekylære forståelse af sygdommen og fremkomsten af ​​målrettede lægemidler, såsom terapeutiske antistoffer og små molekylinhibitorer. I modsætning hertil er metastatisk og tilbagevendende sygdom stadig typisk uhelbredelig, og morbiditet og dødelighed forbliver høje i disse kliniske indstillinger. CSC'er repræsenterer en særskilt subpopulation inden for tumorer og er udstyret med kanoniske stamcelleegenskaber, såsom klonogenicitet / tumoregenicitet, multilægemiddelresistens og asymmetrisk celledeling ^{1 , 2} . CSC'er driver således ikke kun metastatisk progression og tumor heterogenitet, men vedvarer også under behandling for at predisponere patienten for at komme tilbage. Terapeutisk CSC-eliminering er derfor et vigtigt medicinsk behov for at forhindre sygdomstilfælde og tillade langvarig kurbehandling af kræft ³ </sup>.

Identifikation af sårbarheder og belysning af strategier til udryddelse af CSC'er er stærkt afhængig af metoder, der gør det muligt at rense dem fra biologiske prøver til efterfølgende ekspressionsprofilering og / eller funktionel undersøgelse. Til gengæld er sådanne metoder afhængige af overflade-, intracellulære eller funktionelle markører, der er specifikke for disse celler. CSC-specifikke overflademarkører indbefatter, men er ikke begrænset til, CD44, CD133, CD24 og CD90 og er blevet anvendt til at identificere CSC-populationer i en række tumor-enheder, herunder brystkræft og tykktarmscancer ⁴ . En anden markør, aldehyddehydrogenase (ALDH), viser intracellulær lokalisering og kan påvises funktionelt, hvilket tilvejebringer et respektivt substrat, hvis enzymatiske omdannelse giver lys. Ved hjælp af denne test er CSC-populationer også blevet identificeret i forskellige tumor-enheder ⁵ . En komplementær metode, der almindeligvis omtales som SP-analyse og afbildet her i m Etodologisk detaljer, udnytter aktivt farvestof udstrømning af ABC lægemiddeltransportører for at identificere små populationer af fluorescensdæmpede stamlignende celler ^{6 , 7 , 8} . For at opnå dette inkuberes en given prøve i nærværelse af et lipofilt DNA-bindende fluorophore, der kommer ind i alle celler gennem passiv diffusion og målretter atom- og mitokondrielt DNA til binding. Ikke-CSC'er uden ABC-lægemiddeltransportudtryk akkumulerer farvestoffet, hvilket resulterer i lys fluorescens, medens CSC'er ekstruderer farvestoffet aktivt, der reducerer fluorescens. Farmakologisk inhibering af lægemiddeltransportaktivitet ophæver og funktionelt bekræfter SP-fænotypen og bør anvendes til kontrolformål. CSC-populationer, der udviser SP-egenskaber, er blevet beskrevet blandt andet i ovariecancer ^{9 , 10} , prostatacancer ^{11 ,}> 12, brystcancer ¹³ , lungekræft ¹⁴ , endometriecancer ¹⁵ , gliom ^{16 , 17} og knoglesarkom ¹⁸ . Det er vigtigt, at SP-analysen er kompatibel med både kræftcellelinier og primært tumorvæv, selv om primærmateriale udgør yderligere udfordringer, såsom kravet om en specifik tumorcelleforskelsestrategi (visse værtscellepopulationer kan også udvise SP-egenskaber) ^{19 , 20} .

De to mest etablerede SP-overførende lægemiddeltransportører er ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 og ABCG2 / Bcrp1 / CD338 ^{8 , 9 , 21} ; Andre lægemiddeltransportører kan imidlertid også være en molekylær determinant for SP-fænotypen ( f.eks . ABCB5) ²² . ABCB1Kan effektivt blokeres med verapamil, mens aktiviteten af ​​ABCG2 kan ophæves specifikt med fumitremorgin C (FTC) ^{6 , 19} . En særlig styrke i SP-analyse er, at den kan kombineres med andre farvninger ( fx overflademarkører og ALDH), og at det gør det muligt at genoprette levende celle således at være kompatibel med downstream funktionelle undersøgelser. Desuden er SP-detektering bredt anvendelig på grund af den høje bevarelse af ABC-lægemiddeltransportører blandt CSC-populationer ^{9 , 23} .

Oprindeligt er SP-detektion blevet udført ved anvendelse af Hoechst 33342 som et udløsende farvestof ²⁴ . Dette farvestof opnår fremragende opløsning, men kræver ultraviolet laser excitation; Derfor er dets anvendelighed naturligt begrænset til high-end flowcytometriske instrumenter. Adventen af ​​DyeCycle Violet (DCV) ²⁵ har åbnet ny avenuEs til SP analyse og udvidede anvendeligheden af ​​denne metode til standard flowcytometriske instrumenter, der mangler en ultraviolet laser kilde (en violet laser kilde er tilstrækkelig til at løse DCV-SP celler). Det er vigtigt, at Hoechst 33342 og DCV deler fælles pumpespecifikationer, hvilket indikerer, at enten farvestoffer skal identificere de samme cellepopulationer.

Her giver vi en detaljeret forsøgsprotokol af DCV-baseret SP-analyse til hurtig og nem reproduktion i uafhængige laboratorier. Vi opfatter således vores artikel som en ressource for CSC-forskere, der skal bidrage til optimering og standardisering af denne nyttige cellebiologiske metode.

Protocol

Denne protokol er i fuld overensstemmelse med standardinstitutionelle retningslinjer for etisk review. Hvis menneske- eller dyrevæv undersøges ved hjælp af den her beskrevne protokol, er forskerne forpligtet til at få godkendelse fra den relevante revisionskort i deres institution eller land. Forsigtig: Standard forholdsregler for sikker håndtering af biologiske prøver gælder for denne protokol. Dette omfatter iført handsker og et lab coat, og udfører arbejdet under et biosikkerheds…

Representative Results

Forudsat er en repræsentativ SP-analyse af A2780-celler, en human ovariecancercellelinie, der tidligere har vist sig at bære en SP, der regner for mindre end 1% af cellerne 9 . Celler blev dyrket ved 37 ° C i RPMI 1640 suppleret med 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin og høstet ved 85% konfluens ved anvendelse af behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Celler blev vasket i PBS og filtreret gennem 70 μm afskårne afstrygere. …

Discussion

Fremskridt i den kliniske styring af kræft afhænger også af udviklingen af ​​behandlingsmodaliteter, der målretter mod CSC'er. Metoder, der tillader pålidelig isolering af CSC'er fra biologiske prøver, vil fremskynde identificeringen af ​​egnede mål og er derfor af afgørende betydning i denne bestræbelse. SP-analyse er en etableret og værdifuld teknik til at identificere CSC-populationer, der udtrykker ABC-lægemiddeltransportører, og implementeringen af ​​DCV har udvidet dets anvendelighe…

Materials

Vybrant DyeCycle Violet	Thermo Fisher Scientific	V35003	Ready to use
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V4629	Dissolve in ethanol
Fumitremorgin C	Sigma-Aldrich	F9054	Dissolve in DMSO
7-AAD (or propidium iodide)	BioLegend	420403	Ready to use
Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.)	Different suppliers
Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)	Different suppliers
Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter)	Different suppliers		Violet laser source required
FACS tubes (round-bottom)	Different suppliers		Tubes with cap recommended
70 µm cut-off strainers	Different suppliers		Optional but recommended
Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase)	Different suppliers		Only relevant for tissue dissociation
Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest	Different suppliers		Optional
ALDEFLUOR Kit	STEMCELL Technologies	01700	Optional