Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה
Summary
עבודה זו מתארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.
Abstract
טסיות דם הם שחקנים חיוניים בהמוסטזיס, היווצרות של טרומבי לחותם הפרעות בכלי הדם. הם מעורבים גם פקקת, היווצרות של תרומבי כי לכסות את כלי הדם ואת הפגיעה באיברים, עם תוצאות מסכנות חיים. זה מניע מחקר מדעי על תפקוד טסיות ופיתוח שיטות כדי לעקוב אחר תהליכים ביולוגיים התא כפי שהם מתרחשים בתנאי זרימה.
מגוון של מודלים לזרימה זמינים לחקר הדבקה וטסיות טסיות, שתי תופעות מרכזיות בביולוגיה טסיות. עבודה זו מתארת שיטה ללימוד degranulation טסיות בזמן אמת תחת זרימה במהלך ההפעלה. השיטה עושה שימוש בתא הזרימה מצמידים ההתקנה משאבה מזרק ממוקם תחת שדה רחב, הפוך, מבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED. ההתקנה המתוארת כאן מאפשר גירוי סימולטני של fluorophores מרובים אשר מועברים על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently או fluorescצבעים. לאחר ניסויים הדמיה חיה תא, כוסות לכסות ניתן לעבד עוד יותר ונותחו באמצעות מיקרוסקופ סטטי ( כלומר מיקרוסקופיה confocal או מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה).
Introduction
טסיות הדם הן תאים אנוקליאטיות המסתובבות בזרם הדם. הפונקציה העיקרית שלהם היא לחתום הפרות כלי הדם באתרים של פגיעה כדי למנוע אובדן דם. באתרים אלה של פגיעה, סיבי קולגן subendothelial נחשפים והם מכוסים לאחר מכן על ידי חלבון multimeric, פון Willebrand גורם (VWF). VWF אינטראקציה עם טסיות במחזור במנגנון זה תלוי glycoprotein IBA-IX-V מורכבים על פני התא 1 , להאט את מהירות הטסיות. זה חשוב במיוחד בשיעורי גזירה גבוהה. טסיות לאחר מכן לעבור שינויים מורפולוגיים בעת קבלת הפעלת דחפים קולגן. זה מוביל להתפשטות בלתי הפיך ובסופו של דבר צבירה טסיות. שני התהליכים תלויים בהפרשת תכולת גרגירים כדי להקל על קרוסטלקט טסיות טסיות. בין היתר, טסיות α- גרגרים מכילים פיברינוגן ו VWF לסייע הידבקות טסיות לגשרטסיות יחד בצורה תלויי אינטגרין. גרגירי הצפיפות הטסיות מכילים תרכובות אנאורגניות 2 , כולל סידן ואדנוזין diphosphate (ADP), אשר מסייעות לחזק את פעולת הטסיות. יתר על כן, טסיות להכיל מתווכים של דלקת (אלרגית) 3 , משלימים שליטה חלבונים 4 , ו אנגיוגנזה גורמים 5 , 6 , מעלה את השאלה האם וכיצד תוכן אלה משתחררים באופן דיפרנציאלי בתנאים משתנים.
מאז 1980, המחקר של תפקוד טסיות במודלים הזרימה היה בעל ערך לחקירת מנגנוני טרומבוטיים. מאז, התקדמות טכנית רבה נעשתה, מודלים הזרימה הכוללים היווצרות fibrin מפותחים כיום כדי assay הפוטנציאל המוסטטי של ריכוז טסיות טיפולית לשעבר vivo 8 אולחקור את השפעת ההפרעות בשיעורי גזירה על מורפולוגיה 9 . ההבדלים במנגנונים המולקולריים והתאים הביולוגיים שמניעים הידבקות יציבה ויצירת פקקת פיזיולוגית (הימוסטאזיס) לעומת היווצרות פקק פתולוגי (פקקת) עשויים להיות מתוחכמים מאוד ומניעים את התפתחות מודלים הזרימה המאפשרים הדמיה בזמן אמת של תת-תאים אלה תהליכים.
דוגמה לתהליך שעבורו התקנה כזו תהיה בעלת ערך היא ההפצה (re) של polyphosphate תוך תאיים וגיוס גורמים קרישניים כדי לחשוף את ההשפעה תלוי הזמן על זה על תשתית פיברין 10 . מחקרים מוגבלים לעיתים קרובות לניתוח נקודות קצה. המטרה העיקרית של השיטה המתוארת היא לאפשר את החקירה החזותית בזמן אמת של תהליכים תת-דינמיים דינמיים המתרחשים במהלך הפעלת טסיות מתחת לזרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ברחבי העולם, פקקת היא גורם מוביל למוות ולתחלואה, וטסיות משחקות תפקיד מרכזי בהתפתחותה. עבודה זו מתארת שיטה עבור הדמיה תא חי של degranulation טסיות מתחת לזרימה. בדרך כלל מניחים כי כאשר טסיות הדם הופעלות, כל התכנים הגרעיניים משוחררים ישירות לפתרון. התוצאות הנלוות מלמדות כי …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM מודה על תמיכה כספית של הארגון הבינלאומי לחולים לליקויים של C1-Inhibitor (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht וקרן לנדסטיינר לחקר עירוי דם (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Riferimenti
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
