Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi
Summary
Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.
Abstract
Mikrobiyal toplulukların gelişimi, topluluk üyelerinin mekansal dağılımını ve faaliyetlerini önemli ölçüde değiştirebilen karmaşık deterministik ve stokastik faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Binlerce bakteri topluluğunu paralel olarak hızlı bir şekilde bir araya getirmek ve izlemek için kullanılabilecek bir mikro kollu dizi platformu geliştirdik. Bu protokol, platformun kullanımını vurgular ve platform içindeki dizilerin bir topluluğunda basit, iki üyeli toplulukların gelişimini optik olarak izlemek için kullanımını açıklar. Bu gösteri, Tip VI salgı patojenisitesini incelemek üzere geliştirilen bir dizi mutantın bir parçası olan Pseudomonas aeruginosa'nın iki mutantını kullanıyor. MCherry veya GFP genlerinin kromozomal girdileri, her bir mikrowell içindeki topluluk üyelerinin bolluğunu ve konumunu izlemek için kullanılabilen farklı emisyon dalga boylarına sahip floresan proteinlerin yapılı ifadesini kolaylaştırır. Bu protokol ayrıntılı bir metodu açıklamaktadır.D, bakteri karışımlarını dizinin kuyularına monte etmek ve zaman içindeki tüm üye popülasyonun göreli büyümesini ölçmek için zaman atlamalı floresans görüntüleme ve niceliksel görüntü analizi kullanmak için kullanılmıştır. Mikro platformun tohumlanması ve montajı, dizi içindeki mikrobik toplulukların kantitatif analizi için gerekli görüntüleme prosedürleri ve mikrobik tür alanları arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmak için kullanılabilecek yöntemlerin hepsi tartışılmıştır.
Introduction
Mikrobiyal topluluklar, hem hücre ölümü, bölünme, protein konsantrasyonu, organel sayısı ve mutasyon 1 ile ilişkili olan ortamın yapısı ve stokastik süreçler gibi belirleyici faktörler tarafından şekillendirilir 1 . Doğal ortamda, bu etkilerin toplumdaki bileşimi ve etkinliği üzerindeki bireysel etkisini çözümlemek neredeyse imkansız olabilir. Doğal yapılar tarafından örtülmüş ve kimyasal ve biyolojik bir ortamda gömülmüş, topluluk üyelerinin tanımlanması ve doğal çevre içerisinde zaman-zaman dağılımının daha da çözülmesi son derece zorlu bir konudur. Bununla birlikte, son zamanlardaki çabalar, mekânsal organizasyonun topluluk işlevi üzerindeki önemini vurgulamış ve devam eden çalışmalarda hem üye bolluğunu hem de örgütlenmeyi hesaba katma ihtiyacına işaret etmektedir 2 , 3 , 4 .
O, Yerel kimyasal çevrenin (besin maddelerinin ve sekonder metabolitlerin mevcudiyeti), fiziksel yapının ( örneğin toprak yapısı, bitki kökleri, okyanus parçacıkları veya bağırsak mikrovillikleri), oksijenin varlığı veya yokluğunun ve Patojenik türlerin hepsi mikrobiyal toplulukların kompozisyonu, mimarisi ve fonksiyonunu etkiler 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Bununla birlikte, kültürler için bu faktörleri yakalamayı ihmal eden geleneksel teknikler hakim olmaya devam etmektedir. Topluluk bileşimi ( örneğin birlikte bağımlı türlerin varlığı), fiziksel bağlanma, sinyal molekül konsantrasyonu ve direkt hücre-hücre teması, mikrobiyal bir topluluğun şekillenmesi için önemli faktörlerdir ve cÖnceki kültür koşulları. Bu özelliklerin bir toplu sıvı kültüründe veya bir agar plakasında kopyalanması zordur. Bununla birlikte, doğal ortamların önemli fiziksel ve kimyasal özelliklerinin çoğaltılmasına izin veren mikroakışkan, mikro-modelleme ve nanofabrikasyon teknikleri, birçok araştırmacıya, 12 , 13 , 14 arasındaki etkileşimleri incelemek için bakteriyel topluluklar inşa ettirdi ve Doğal koşulları 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20'yi taklit edin.
Bu protokol, bir mikrodellek dizilimi cihazı imal etmek için bir yöntem açıklamaktadır ve bu yöntemin işlevselleştirilmesi için kullanılabilecek ayrıntılı deneysel prosedürler sağlamaktadır.Hem kuyuları hem de tek tür kolonileri olarak ve çok üyeli topluluklarda bakteri yetiştirmek için kullanıldı. Bu çalışma aynı zamanda, floresan muhabir proteinleri üretmek üzere modifiye edilen bakterilerin, zaman içinde kuyu içerisindeki bakterilerin büyümesini izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Benzer bir dizi daha önce sunulmuş ve mikrowelllerde Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) tek tür kolonilerin büyümesini izlemek mümkün olduğunu göstermiştir. Kuyu boyutu ve ekim yoğunluğunu modüle ederek, binlerce büyüme deneyinin başlangıç koşulları, ilk inokülasyon koşullarının bakterilerin yetişme yeteneğini nasıl etkilediğini belirlemek için paralel olarak değiştirilebilir. Mevcut çalışma, çoklu dizilerin eşzamanlı karşılaştırılmasını sağlayarak ve daha sağlam bir deney protokolü kullanarak önceki çalışmaya dayanan mikrodevre dizisinin biraz değiştirilmiş bir sürümünü kullanıyor. Bu çalışmada kullanılan dizi, çoklu alt sıralar veya dizi ensem içerirÇapları 15 – 100 μm arasında değişen, üç farklı aralıklarla ( yani , kuyu çapında 2x, 3x ve 4x) düzenlenmiş farklı boyutlarda oyuklar içeren oyuklar. Diziler silikona kazınır ve silikon dizilerde tohumlanan bakterilerin büyümesi, orta-enfüze bir agaroz jeli ile kaplanmış bir lamel ile dizileri sızdırmaz hale getirerek etkinleştirilir. Bu demonstrasyonda Tip VI sekresyon sistemini incelemek üzere tasarlanmış P. aeruginosa mutantları kullanılır.
Burada sunulan sonuçlar, mikrowell dizilerdeki çok elemanlı toplulukların analizinin nihai hedefine doğru inşa ederek, araştırmacıların kimyasal çevrenin kontrol edilmesi ve araştırılması sırasında yerinde bakterilerin bolluğunu ve organizasyonunu izlemesini sağlıyor. Bu, nihayetinde topluluk gelişimini ve halefiyetini yöneten "kurallar" hakkında fikir verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, bakteri topluluğunun gelişiminin yüksek verimli ve yüksek içerikli canlı hücre görüntüleme tabanlı analizini mümkün kılmak için tasarlanmış bir mikrodalkaralı dizi cihazı ve deney protokollerini sundu. Buradaki gösterinin odağı, temas yoluyla aracılık edilen Tip VI sekresyonun topluluk gelişimine etkilerini incelemek iken, diziler esnek olacak şekilde tasarlandı ve geniş bir mikrobik topluluklar mikrobik-mikrop etkileşimleri çalışmasına uyacak şekilde tasarlandı. Buradaki ç…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mikrokoşa diziler, Nanofaze Malzeme Bilimleri Merkezi Kullanıcı Tesisleri Bölümü, Temel Enerji Bilimleri Ofisi, ABD Enerji Bakanlığı tarafından imal edildi ve karakterize edildi. Bu çalışma için maddi destek Oak Ridge Ulusal Laboratuar Direktörü Araştırma ve Geliştirme Fonu aracılığıyla sağlandı. Yazarlar ayrıca, bu araştırmalarda kullanılan P. aeruginosa suşlarının temini için J. Mougous Laboratuvarına (Washington Üniversitesi, Seattle, WA) teşekkür etmek istiyorlar .
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
Riferimenti
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
