Montering och spårning av mikrobiell gemenskapsutveckling inom en Microwell Array-plattform
Summary
Utvecklingen av mikrobiella samhällen beror på en kombination av faktorer, bland annat miljöarkitektur, medlemmens överflöd, egenskaper och interaktioner. Detta protokoll beskriver en syntetisk, mikrofabrikad miljö för samtidig spårning av tusentals samhällen som finns i femtoliter brunnar, där viktiga faktorer som nischstorlek och inneslutning kan approximeras.
Abstract
Utvecklingen av mikrobiella samhällen beror på en kombination av komplexa deterministiska och stokastiska faktorer som dramatiskt kan förändra rumsfördelningen och aktiviteterna hos medlemmar i samhället. Vi har utvecklat en mikrowell array plattform som kan användas för att snabbt montera och spåra tusentals bakteriella samhällen parallellt. Detta protokoll belyser plattformens användbarhet och beskriver dess användning för att optiskt övervaka utvecklingen av enkla, två medlemmarsamhällen inom ett ensemble av arrays inom plattformen. Denna demonstration använder två mutanter av Pseudomonas aeruginosa , en del av en serie mutanter utvecklade för att studera typ VI-sekretionspatogenitet. Kromosomala insatser av antingen mCherry eller GFP-gener underlättar det konstitutiva uttrycket av fluorescerande proteiner med distinkta emissionsvåglängder som kan användas för att övervaka samhällsmedlemsöverskott och plats inom varje mikrowell. Detta protokoll beskriver en detaljerad metodD för att montera blandningar av bakterier i brunnarna i matrisen och använda tidsförlängningsfluorescensavbildning och kvantitativ bildanalys för att mäta den relativa tillväxten av varje medlemspopulation över tiden. Mikrowellplattens sådd och sammansättning, de bildbehandlingar som krävs för den kvantitativa analysen av mikrobiella samhällen inom matrisen och de metoder som kan användas för att avslöja interaktioner mellan mikrobiella arter som diskuteras.
Introduction
Mikrobiella samhällen formas av både deterministiska faktorer, såsom miljöens struktur och stokastiska processer, som är associerade med celldöd, uppdelning, proteinkoncentration, antal organeller och mutation 1 . Inom den naturliga miljön kan det vara nästan omöjligt att analysera de individuella effekterna av dessa påverkningar på gemenskapens sammansättning och aktivitet. Obscured av naturliga strukturer och begraven inom en kemisk och biologisk miljö, är det extremt utmanande att identifiera medlemmar i samhället och vidare lösa sin spatiotemporal fördelning inom den naturliga miljön. De senaste ansträngningarna har dock underströk betydelsen av den regionala organisationen för samhällsfunktionen och pekar på behovet av att redogöra för både medlemmens överflöd och organisation i pågående studier 2 , 3 , 4 .
DetDet är tydligt att den lokala kemiska miljön ( dvs. tillgången på näringsämnen och sekundära metaboliter), den fysiska strukturen ( t.ex. jordarkitektur, växtrotsor, havspartiklar eller intestinala mikrovilli), närvaro eller frånvaro av syre och införandet av Patogena arter påverkar sammansättningen, arkitekturen och funktionen hos mikrobiella samhällen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Ändå fortsätter traditionella tekniker för kulturer som försummar att fånga dessa faktorer att råda. Gemenskapens sammansättning (till exempel närvaron av medberoende arter), fysisk bindning, signalmolekylkoncentration och direktcellcellskontakt är alla viktiga faktorer för att forma ett mikrobiellt samhälle och kan gå vilse i cOvannämnda kulturbetingelser. Dessa egenskaper är svåra att replikera i en bulkvätskekultur eller på en agarplatta. Tillgången till mikrofluidiska, mikropatterning och nanofabrikationstekniker som möjliggör replikering av centrala fysikaliska och kemiska egenskaper hos naturmiljöer har dock gjort det möjligt för många forskare att bygga bakteriegemenskaper för att studera deras interaktioner 12 , 13 , 14 och att utveckla syntetiska miljöer som Efterlikna naturliga tillstånd 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Detta protokoll beskriver en metod för att tillverka en microwell array-enhet och ger detaljerade experimentella förfaranden som kan användas för att funktionalisera thE brunnar i matrisen och växa bakterier, både som enskilda kolonier och i flera medlemmarsamhällen. Detta arbete visar också hur bakterier modifierade för att producera fluorescerande reporterproteiner kan användas för övervakning av bakteriell tillväxt i brunnar över tiden. En liknande matris presenterades tidigare och visade att det är möjligt att spåra tillväxten av enskilda arter kolonier av Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) i mikrovågor. Genom att modulera brunnstorlek och sådddensitet kan startförhållandena för tusentals tillväxtexperiment varieras parallellt för att bestämma hur de initiala inokulationsförhållandena påverkar bakteriens förmåga att växa 21 . Det aktuella arbetet använder en lite modifierad version av mikrowell-arrayen som bygger på det föregående arbetet genom att möjliggöra samtidig jämförelse av flera arrayer och genom att använda ett mer robust experimentprotokoll. Arrayen som används i det här arbetet innehåller flera undergrupper, eller array ensemBles, som innehåller brunnar i olika storlekar, som sträcker sig från 15 till 100 μm i diameter, som är anordnade på tre olika ställen ( dvs 2x, 3x och 4x brunnsdiametern). Arrayerna är etsade i kisel och tillväxten av bakterierna som utsöndras i kiseluppsättningarna möjliggörs genom att försegla arraysna med en täckglas som har belagts med en medium-infuserad agarosgel. P. aeruginosa- mutanter avsedda att studera typ VI-sekretionssystemet används i denna demonstration.
Resultaten som presenteras här bygger upp mot det ultimata målet att analysera multimembergemenskaper inom mikrovågsskivor, vilket gör det möjligt för forskare att övervaka bakteriens överflöd och organisation på plats samtidigt som man kontrollerar och undersöker den kemiska miljön. Detta borde slutligen ge insikter i "reglerna" som styr samhällsutveckling och arv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln presenterade en mikrowell array-enhet och experimentella protokoll som är utformade för att möjliggöra högkvalitativ och hög innehållsinriktad analys av levande celler av bakteriell samhällsutveckling. Medan demonstrationens fokus här var att studera effekterna av kontaktmedierad typ VI-sekretion på samhällsutveckling, var arraysna utformade för att vara flexibla och rymma studien av ett brett spektrum av mikrobiella samhällen och mikro-mikrobi-interaktioner. Arbetet här fokuserar enbart …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microwell-arrays tillverkades och karaktäriserades vid Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Ekonomiskt stöd till detta arbete har skett genom Oak Ridge National Laboratory Director Research and Development Fund. Författarna skulle också vilja tacka J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) för tillförsel av P. aeruginosa- stammar som användes i dessa studier.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
Riferimenti
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
