腹部色素沈着の定量化<em>ショウジョウバエmelanogaster</em
Summary
この研究は、デジタル画像解析を用いてショウジョウバエの腹部色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法を提示する。この方法は、表現型の取得とデータ解析との間の手順を合理化し、標本のマウント、画像取得、画素値抽出、形質測定を含む。
Abstract
色素沈着は形態学的に単純であるが、しばしば適応性のある特徴を有する非常に可変性の形質である。それは、形態学的表現型の発達および進化を理解するためのモデルとして広範に役立ってきた。 Drosophila melanogasterの腹部色素沈着は特に有用であり、研究者は形態間および体内特異的変異の根底にある遺伝子座を同定することができます。しかしながら、 D.メラノガスターの腹部色素沈着は、色素沈着データに適用され得る統計学的分析の形態を制限する定量的ではなく、スコアリングによって定性的に大部分検定されてきた。この研究は、成人D. melanogasterの腹部色素沈着パターンの様々な局面の定量化を可能にする新しい方法論を記述している。このプロトコールは、標本のマウント、画像キャプチャ、データ抽出、および分析を含む。画像の取り込みと解析に使用されるすべてのソフトウェアは、マクロオープンソースの画像解析用に書かれています。このアプローチの利点は、異なるイメージングシステムにわたって再現性の高い方法論を使用して、色素沈着特性を正確に測定する能力である。この技術は、成虫のメラノガスターの褐色色素沈着パターンの変動を測定するために使用されてきたが、この方法論は柔軟性があり、無数の異なる生物における色素沈着パターンに広く適用可能である。
Introduction
色素沈着は、種、個体群、個体間、さらには個体群1,2,3,4,5,6において、個体間でさえ莫大な表現型の変化を示す 。多種多様な動物で色素沈着に関する研究が数多く行われていますが、色素沈着を調節する発達的および生理学的機序を解明するために分子遺伝学の完全な力が使用され、これらのメカニズムがどのように進化するかについて、Drosophila melanogaster 、 6 。 D.メラノガスター（melanogaster）7,8の生化学的合成を制御する遺伝子、および時間的および空間的なディーを制御する遺伝子については、多くのことが知られているこの生合成のストリエーション9,10,11,12,13。さらに、遺伝的マッピングは、 D.メラノガスター（ Melanogaster）14,15,16,17において色素沈着における細胞内および細胞間の相違の根底にある遺伝子座を同定した。行動18,19および免疫19,20などの色素沈着と多面発現形質との間の関係も、色素沈着パターン15,21,22の適応的意義を有するように探究されている。したがって、 D.メラノガスターの色素沈着は、強力でしかも単純なm複雑な表現型の発達と進化のためのodel。
成人の色素沈着D.メラノガスターは、特に翼と背側の胸部と腹部の体のメラニン化パターンが特徴です。しかし、最も研究の注目を集めているのは背側腹部の各クチクラ板（tergite）の色素沈着である。遺伝的な17,23および環境的な24,25の両方の要因のために、この色素沈着にはかなりの変動がある（ 図 1A〜F）。腹部硬質のクチクラは、前部および後部の発生区画（ 図1G ）で構成され、それぞれが色素沈着および装飾に基づいてさらに細分化することができる26 。前部区画は、6つのクチクラ（a1-a6）を含み、後区画は3つ（p1-p3）を含む（ 図1G ）。これらのうち、p1、p2、およびa1キューティクルは、典型的には、引き伸ばされていない腹部のターガイトの下に折りたたまれ、隠される。確実に目に見えるキューティクルは、キューティクルタイプa4（中程度の剛毛を有する毛状）およびa5（毛状の毛状）からなる「色素バンド」と呼ばれる重い色素沈着のバンドによって特徴付けられ、バンドの後端前縁よりも強く色素沈着した（ 図1G ）。このバンドの前部は、明るく着色した毛状のキューティクルの領域であり、後部に（a3）剛毛があり、前部にはa2ではない。ハエ間の色素沈着の変動は、色素沈着の強度および色素バンドの幅の両方で観察される。一般に、変動は、最も後部のセグメント（腹部セグメント5,6,7）において最も大きく、より前方のセグメント（腹部セグメント3および4項） 24 。さらに、 D. melanogasterの色素沈着に性的な二型性があり、男性は一般的に全身に5番目と6番目の腹部を着色しています（ 図4C ）。
D.メラノガスターの腹部色素沈着に関する大部分の研究では、色素沈着は、質的に27,28,29または半定量的に14,15,16,17,24,30の尺度で測定されたパターンを有する、類型的または序数的形質として扱われている、 31,32,33,34,35、 36,37 。これらの方法は、必然的に精度の欠如に悩まされており、色素沈着の主観評価に依存しているため、研究を通してデータを比較することは困難である。いくつかの著者は、色素沈着の空間的な大きさ38,39 、特定のキューティクルタイプの色素沈着の強度23,25,39,40、または腹部テルグタイト全体の色素沈着の平均強度を全体として41,42,43として定量化した。それにもかかわらず、これらの定量方法は、腹部色素沈着の強度および空間分布の両方を同時に測定するものではなく、従って、色素沈着がabd全体でどのように変化するかのニュアンス最終的なtergite。さらに、これらの定量化方法38,41,42,43のいくつかは、腹部キューティクルの解剖および装着を必要とする。これは時間がかかり、サンプルを破壊し、追加の形態学的解析に利用できなくなる。腹部色素沈着の発達および進展の理解が深まるにつれて、空間分布および色素沈着の強度の両方を迅速かつ正確に測定するより洗練されたツールが必要となる。
この方法の全体的な目標は、 D. melanogasterにおける腹部色素沈着の複製可能かつより正確な測定値を得るためにデジタル画像分析を利用することである。方法論は3つの段階を含む。まず、大人のフライは非破壊的に装着され、背面の腹部のデジタル画像が撮影されます。次に、ImageJマクロを使用して、ユーザー第3および第4の腹部セグメントの両方においてa2キューティクルの前部からa5キューティクルの後部（緑色のボックス、 図1G ）まで延在するピクセルの前 – 後部ストリップを画定する。次いで、このストリップの幅にわたる平均ピクセル値がその長軸に沿って抽出され、それがターゲットの前部から後部に変化する際の色素沈着の空間分布および強度を捕捉するプロファイルを生成する。第3に、Rスクリプトを使用して、三次スプラインを使用して数学的に色素沈着プロファイルを記述する。 Rスクリプトはスプラインとその1次微分と2次微分を使用してa2-a5キューティクルの幅、色素バンドの幅、色素沈着の最大レベルと最小レベルを抽出します。従って、本方法は、空間的特性と腹部色素沈着の深さの両方を定量化する。
この方法論は、第3および第4の腹部胸部の色素沈着を定量化し、排他的に、またはより多くの後部ヘルニアと組み合わせて、多数の先行研究1、15、23、24、25、28、33、39、42の焦点であった。第5および第6腹部テルゲイトよりも変化は少ないが、第3および第4テルゲイトは男性において完全に色素沈着していないので、このプロトコルは男性および女性の両方に適用することができる。それにもかかわらず、ここに示すように、プロトコルは、女性の第5および第6腹部腸内細菌の色素沈着を測定するために使用することができる。さらに、色素沈着プロフィールの特徴を抽出するために使用されるスクリプトのわずかな変更は、この方法を使用して、多種多様な色素沈着における変化を定量化することを可能にすべきである生物。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法論により、複数の下流分析に適した定量的形態での色素沈着データの正確で迅速かつ再現性のある取得が可能になる。この方法は、同種のハエの系統における腹部色素沈着に及ぼす温度の影響に関するデータを得るために使用されてきた。しかし、方法論は、個体、個体群、または種間の色素沈着の差異の基礎となる遺伝子、または色素沈着パターンに対する特定の遺伝子の影響を?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1256565とIOS-1557638がAWSに資金提供しました。このペーパーの以前のバージョンに対する彼らの有益なコメントについてPatricia Wittkoppと3人の匿名の批評家に感謝します。
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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