Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes
Summary
Ce protocole décrit des méthodes pour purifier, quantifier et caractériser les vésicules extracellulaires (EV) / les exosomes provenant de cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses et pour les utiliser pour transférer la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules épithéliales mammaires luminescentes. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige peuvent transférer cette propriété cellulaire vers des cellules qui ingerent les EV / exosomes.
Abstract
Les cellules peuvent communiquer via des exosomes, des vésicules extracellulaires de 100 nm (EV) qui contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques. Les vésicules extracellulaires dérivées des cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses (NAMEC) peuvent être isolées à partir du milieu NAMEC par ultracentrifugation différentielle. Sur la base de leur densité, les EV peuvent être purifiés par ultracentrifugation à 110 000 x g. La préparation EV de l'ultracentrifugation peut être séparée davantage en utilisant un gradient de densité continue pour éviter la contamination par des protéines solubles. Les EV purifiés peuvent ensuite être évalués à l'aide d'une analyse de suivi des nanoparticules, qui mesure la taille et le nombre de vésicules dans la préparation. Les vésicules extracellulaires d'une taille allant de 50 à 150 nm sont des exosomes. Les EV / exosomes dérivés de NAMEC peuvent être ingérés par des cellules épithéliales mammaires, qui peuvent être mesurées par cytométrie de flux et microscopie confocale. Certaines propriétés de cellules souches mammaires ( p. Ex., Capacité de formation de glandes mammaires) peuventÊtre transféré des NAMEC de type tige aux cellules épithéliales mammaires via les EV / exosomes dérivés de NAMEC. Les cellules épithéliales mammaires primaires primaires isolées EpCAM hi / CD49f lo luminal ne peuvent pas former de glandes mammaires après avoir été transplantées dans des tampons à graisse de souris, tandis que les cellules épithéliales mammaires basiques EpCAM lo / CD49f hi forment des glandes mammaires après une transplantation. L'absorption des EV / exosomes dérivés de NAMEC par les cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal leur permet de générer des glandes mammaires après avoir été transplanté dans des graisses. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige transfèrent la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal.
Introduction
Les exosomes peuvent méditer la communication cellulaire en transférant des protéines membranaires et cytosoliques, des lipides et des ARN entre les cellules 1 . La communication à médiation exosome a été démontrée comme impliquant de nombreux processus physiologiques et pathologiques ( ex: présentation de l'antigène, développement de la tolérance 2 et progression de la tumeur 3 ). Les exosomes ont souvent des contenus similaires à ceux des cellules sources qui les libèrent. Ainsi, les exosomes peuvent transporter des propriétés cellulaires spécifiques des cellules sources et transférer ces propriétés aux cellules qui les ingestion 4 .
Les exosomes sont des vésicules membranaires à double couche de 50 à 150 nm et présentent des marqueurs spécifiques ( p. Ex., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101). Ainsi, les exosomes doivent être caractérisés par diverses méthodes pour différents aspects. La microscopie électronique à transmission peut être utilisée pour visualiser les vésicules membranairesTels que les exosomes 4 , 5 . L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et l'analyse dynamique de la diffusion de la lumière (DLS) sont utilisées pour mesurer la taille et le nombre d'exosomes purifiés 4 . La teneur en membrane lipidique des exosomes peut être vérifiée par gradient de densité. Les marqueurs exosomaux, tels que CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101 6 , 7 , peuvent être mesurés par Western Blot.
Les cellules basales mammaires ont la capacité de générer des glandes mammaires lorsqu'elles sont implantées dans des tampons à graisse, tandis que les cellules luminaires ne peuvent pas 8 , 9 , 10 . Ainsi, les cellules basales mammaires sont également appelées unités reproductrices mammaires. En utilisant le modèle de cellules mammaires basales et luminales, on peut examiner la capacité des EV / exosomes à transférer les caractéristiques cellulaires entre différentes populations cellulaires. Ce travailDémontre la méthode de transfert de la capacité de formation de glande des cellules épithéliales basales mammaires aux cellules épithéliales luminescales mammaires en utilisant EVs / exosomes dérivés de cellules épithéliales basales mammaires. Les cellules épithéliales mammaires luminal ont acquis des propriétés basales après l'ingestion d'EV / exosomes sécrétés à partir de cellules basales et peuvent alors former des glandes mammaires 4 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Les exosomes portent souvent des caractéristiques des cellules qui les libèrent, et la quantité d'exosomes libérés peut être induite par des stimuli 4 . Le milieu de culture des cellules peut être collecté et soumis à une ultracentrifugation différentielle pour la collecte EV / exosome ( figure 1 ). Il n'existe actuellement aucun accord général sur une méthode idéale pour isoler EV / exosomes. La méthode optimale utilisée ici a été détermin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts nationaux de recherche en santé (05A1-CSPP16-014, HJL) et du Ministère de la science et de la technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/ml = 5 U/ml |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15-cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10-cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
Riferimenti
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes–vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells – a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
