Overføring av Mammary Gland-forming Ability Mellom Mammary Basal Epithelial Cells og Mammary Luminal Cells Via Extracellular Vesicles / Exosomes
Summary
Denne protokollen beskriver metoder for rensing, kvantifisering og karakterisering av ekstracellulære vesikler (EVs) / eksosomer fra ikke-adherent / mesenkymale brystepitelceller og for bruk av dem for å overføre brystkjerteldannende evne til luminale brystepitelceller. EVs / eksosomer avledet fra stamlignende brystepitelceller kan overføre denne celleegenskapen til celler som inntar EVs / eksosomer.
Abstract
Celler kan kommunisere via eksosomer, ~ 100 nm ekstracellulære vesikler (EVer) som inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) -deriverte ekstracellulære vesikler kan isoleres fra NAMEC medium via differensial ultracentrifugering. Basert på dens tetthet kan EVs renses via ultracentrifugering ved 110.000 x g. EV-preparatet fra ultracentrifugering kan separeres ytterligere under anvendelse av en kontinuerlig tetthetgradient for å forhindre forurensning med løselige proteiner. De rensede EV-stoffene kan deretter evalueres ytterligere ved hjelp av nanopartikkel-sporingsanalyse, som måler størrelsen og antall vesikler i preparatet. De ekstracellulære vesiklene med en størrelse som strekker seg fra 50 til 150 nm er eksosomer. De NAMEC-avledede EV / eksosomer kan inntas av brystepitelceller, som kan måles ved hjelp av flytcytometri og konfokal mikroskopi. Enkelte brystkreftegenskaper ( f.eks. Brystkreftdannende evne) kanOverføres fra stamme-lignende NAMECer til brystepitelceller via de NAMEC-avledede EV / eksosomer. Isolerte primære EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller kan ikke danne brystkjertler etter transplantering i musfettputer, mens EpCAM lo / CD49f hi basale brystepitelceller danner brystkjertler etter transplantasjon. Opptak av NAMEC-avledede EV'er / eksosomer av EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller gjør det mulig for dem å generere brystkjertler etter transplantering i fettputer. EV-ene / eksosomene avledet fra stamlignende brystepitelceller overfører brystkjerteldannende evne til EpCAM hi / CD49f luminale brystepitelceller.
Introduction
Eksosomer kan formidle cellulær kommunikasjon ved å overføre membran og cytosoliske proteiner, lipider og RNAer mellom celler 1 . Eksosomediert kommunikasjon har blitt vist å være involvert i mange fysiologiske og patologiske prosesser ( dvs. antigenpresentasjon, utvikling av toleranse 2 og tumorprogresjon 3 ). Eksosomer har ofte innhold som ligner på kildekildene som frigjør dem. Eksosomene kan således bære spesifikke celleegenskaper fra kildecellene og overføre disse egenskapene til cellene som inntar dem 4 .
Eksosomer er 50- til 150 nm dobbeltlags membranvesikler og nåværende spesifikke markører ( f.eks. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix og TSG101). Eksosomer må derfor preges av ulike metoder for ulike aspekter. Overføringselektronmikroskopi kan brukes til å visualisere membranvesiklerSom eksosomer 4 , 5 . Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og dynamisk lysspredningsanalyse (DLS) brukes til å måle størrelsen og antall rensede eksosomer 4 . Lipidmembraninnholdet i eksosomer kan verifiseres ved tetthetgradient. Eksosomale markører, slik som CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix og TSG101 6 , 7 , kan måles ved Western blotting.
Mammare basale celler har evnen til å generere brystkjertler når de implanteres i fettputer, mens luminale celler ikke kan 8 , 9 , 10 . Således refereres også basale celler i brystet til brystrepopulerende enheter. Ved bruk av modellen av basale og luminale celler i brom kan evnen til EV / eksosomer for å overføre celleegenskaper mellom forskjellige cellepopulasjoner undersøkes. Denne jobbenDemonstrerer metoden for å overføre kjerteldannende evne fra brystbasale epitelceller til mammale luminale epitelceller ved bruk av EVer / eksosomer avledet fra basale epithelialceller fra bryst. Luminale brystepitelceller kjøpte basalcelleegenskaper etter inntak av EV / eksosomer utskilt fra basale celler og kan deretter danne brystkjertler 4 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksosomer har ofte egenskaper av cellene som frigjorde dem, og mengden av frigjorte eksosomer kan induseres av stimuli 4 . Kulturmediet fra celler kan samles og underkastes differensial ultracentrifugering for EV / eksosom samling ( Figur 1 ). Det er for øyeblikket ingen generell avtale om en ideell metode for å isolere EV / eksosomer. Den optimale fremgangsmåten som brukes her er blitt bestemt av nedstrømsapplikasjonen 14 . Ultracentrifug…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) og fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/ml = 5 U/ml |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15-cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10-cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
Riferimenti
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes–vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells – a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-‘t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
