Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor
Summary
Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.
Abstract
Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de drogas ou toxinas dentro de áreas específicas do cérebro e, mais recentemente, eles têm sido utilizados para entregar produtos de terapia genética ou célula. Infelizmente, as técnicas de microinjeção atual usar agulhas de aço ou vidro, que são de qualidade inferior por várias razões: em particular, agulhas de aço podem causar danos nos tecidos e agulhas de vidro podem dobrar quando abaixado profundamente no cérebro, ausente da região de destino. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo que combinam um número de características úteis. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e, sendo muito rígida, garantir a entrega confiável na região desejada cérebro mesmo quando usando coordenadas profundas. Além disso, é possível personalizar o design da agulha, fazendo vários furos do diâmetro desejado. Vários furos facilitam a injeção de grandes quantidades de solução dentro de uma área maior, Considerando que grandes buracos facilitam a injeção de células. Além disso, estas agulhas de quartzo podem ser limpos e reutilizadas, tal que o procedimento se torna rentável.
Introduction
Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de compostos farmacologicamente ativos de modular a atividade neuronal em áreas específicas do cérebro. Além disso, eles têm sido usados para injetar toxinas perto de populações neuronais particulares, para imitar neurodegenerativas eventos característicos de determinadas doenças, por exemplo 6-hidroxi-dopamina no sistema de dopamina nigrostriatal para imitar a doença de Parkinson 1 , 2 ou o saporin de IgG immunotoxin 192 a lesão do sistema colinérgico3. Mais recentemente, procedimentos de microinjeção tem sido usados para entregar enxertos de vetores ou células virais para terapia de gene ou célula cerebral experimental transtornos4,5.
O tipo clássico de agulhas utilizadas nestes estudos é feito de aço inoxidável. Apesar de fácil e prático de usar, agulhas de aço têm um número de problemas6: eles são relativamente grandes e podem danificar o tecido, com vazamento da barreira hemato – encefálica e ativação de astrócitos; Além disso, eles podem produzir dielétrico de tecido cerebral que entra a agulha, criando um obstáculo, ou até mesmo completamente evitando o fluxo da solução desejada. Mais recentemente, agulhas de vidro preparado ad hoc dos capilares foram introduzidas no usam7,8. Estas não causam ativação de danos nem astrocyte significativa de tecido, mas são relativamente flexíveis e podem dobrar quando introduzida em estruturas profundas, reduzindo a precisão da localização (observações pessoais).
Portanto, há uma necessidade de reduzir, tanto quanto a possíveis danos (especialmente ao realizar experimentos para curar danos) aumentando a precisão e reprodutibilidade (i.e., certifique-se de que toda solução é entregue e assegurar a localização correta). Além disso, seria desejável usar projetos diferentes da agulha para garantir uma distribuição ideal da solução injetada em áreas do cérebro com diferentes geometrias. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo para alevinos do cérebro de roedor. Devido ao alto ponto de fusão, capilares de quartzo não podem ser puxados em um extrator convencional e, portanto, tem não sido usados no passado para gerar agulhas. Quartzo, no entanto, oferece algumas vantagens importantes sobre o vidro, em particular de alta rigidez e quebra resistência9. Por causa da sua rigidez, agulhas de quartzo são ideais para injeções em regiões do cérebro ventral. Por causa de sua alta resistência à quebra, eles podem ser modelados para incluir vários furos, obtendo projetos que possam revelar-se mais eficazes mesmo quando segmentando regiões do cérebro com geometrias complexas10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica descrita neste artigo cumpre as necessidades descritas na introdução para otimizar alevinos que são executados para vários fins12. As agulhas descritas aqui reduzem o dano a um nível mínimo, essencialmente não-detectável; a variância com agulhas de vidro (que são propensas a dobrar), agulhas de quartzo são rígidas e certifique-se de um hit confiável da região cerebral desejado mesmo em profundas coordenadas. Além disso, o furo lateral garante entrega da s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho tem sido apoiado por uma subvenção da Comunidade Europeia [projecto FP7-pessoas-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
Riferimenti
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