क्षणिक अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं में
Summary
Nonlytic कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली उत्पादन, सेलुलर तस्करी / स्थानीयकरण, और पुनः संयोजक प्रोटीन कार्यात्मक विश्लेषण के लिए underutilized कर रहे हैं। यहाँ, हम तरीकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lepidopteran सेल लाइनों में अभिव्यक्ति वैक्टर और बाद क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति उत्पन्न करने के लिए का वर्णन। Subcellular फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन के साथ Bemisia tabaci aquaporins के सह स्थानीयकरण भी प्रस्तुत किया है।
Abstract
, सेलुलर तस्करी / स्थानीयकरण की व्याख्या, और उप जीवधारी स्तर पर प्रोटीन की जैव रासायनिक समारोह के निर्धारण Heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। baculovirus अभिव्यक्ति सिस्टम तेजी से कई जैव प्रौद्योगिकी, दवा, और औद्योगिक अनुप्रयोगों, nonlytic प्रणाली है कि वायरल संक्रमण स्पष्ट लाभ शामिल नहीं है, लेकिन अक्सर अनदेखी और underutilized कर रहे हैं में प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है यद्यपि। यहाँ, हम nonlytic अभिव्यक्ति वैक्टर और क्षणिक पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन। यह प्रोटोकॉल पुनः संयोजक प्रोटीन के कुशल सेलुलर स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है और तेजी से कोशिका के भीतर प्रोटीन की तस्करी विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। हम कीट Bemisia tabaci से दो aquaporin प्रोटीन सहित एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीट सेल लाइन में चार पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति, दिखाने के लिए, साथ हीसेल प्लाज्मा झिल्ली के लिए विशिष्ट subcellular मार्कर प्रोटीन के रूप में और intracellular लाइसोसोम के लिए। सभी पुनः संयोजक प्रोटीन उनके कार्बाक्सिल टर्मिनी, जो पुनः संयोजक प्रोटीन के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के साथ काइमेरा के रूप में तैयार किए गए। प्लास्मिड ब्याज और एक ज्ञात subcellular मार्कर के जीन के लिए निर्माणों को शरण देने के साथ कोशिकाओं की डबल अभिकर्मक लाइव सेल इमेजिंग और सेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण के बेहतर सत्यापन के लिए अनुमति देता है।
Introduction
कीट सेल अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन यूकेरियोटिक प्रोटीन के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करता है। अर्थात्, कीट कोशिकाओं समान बाद translational संशोधनों, प्रसंस्करण, और स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद लोगों, जो ठीक से मुड़ा हुआ प्रोटीन 1, 2, 3 के उत्पादन के लिए फायदेमंद है के रूप में छँटाई तंत्र के अधिकारी। कीट सेल सिस्टम भी आम तौर पर स्तनधारी सेल लाइनों 4, 5 से रखरखाव के लिए कम संसाधनों और कम समय और प्रयास की आवश्यकता है। baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली एक ऐसी कीट सेल आधारित प्रणाली, प्रोटीन लक्षण वर्णन और चिकित्सा विज्ञान, विदेशी पेप्टाइड और टीका उत्पादन के लिए वायरल प्रोटीन की immunogenic प्रस्तुति, बहु के संश्लेषण के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन सहित कि है अब व्यापक रूप से कई विषयों में प्रयोग किया जाता है -protein परिसरों, ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के उत्पादन, आदि। 1, 2, 4, 6। कर रहे हैं, हालांकि, परिस्थितियाँ होती हैं जिनमें baculovirus अभिव्यक्ति नहीं लागू 3, 7, हो सकता है और nonlytic और क्षणिक कीट अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। विशेष रूप से, क्षणिक कीट सेल अभिव्यक्ति पुनः संयोजक प्रोटीन का तेजी से संश्लेषण के लिए संभावना प्रदान करता है, कम विकास और रखरखाव की आवश्यकता है, वायरल लगाया सेल को शामिल नहीं करता, और बेहतर प्रोटीन संश्लेषण 7, 8, 9 के दौरान सेलुलर तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है, 10।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अभिव्यक्ति वैक्टर का तेजी से पीढ़ी का वर्णन करता है दो कदम ओवरलैप विस्तार पीसीआर (ँ पीसीआर) <sup class = "xref"> 11 और Escherichia कोलाई में प्लाज्मिड डीएनए के मानक क्लोनिंग। प्लास्मिड डबल transfect व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं को इस्तेमाल कर रहे हैं और प्रतिनिधि प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए। प्रोटोकॉल उत्पादन और दो अलग अलग fluorescently लेबल subcellular मार्कर प्रोटीन का उपयोग का वर्णन करता है और कीट Bemisia tabaci से दो aquaporin प्रोटीन के साथ colocalization को दर्शाता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ँ पीसीआर, लक्ष्य प्रोटीन की सेलुलर स्थानीयकरण के लिए कीट सेल रखरखाव और अभिकर्मक, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए बुनियादी पद्धति प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक कई बहाव के अनुप्रयोगों 4 में इस्तेमाल किया प्रोटीन के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। उपलब्ध विविध अभिव्यक्ति सिस्टम से चयन ब्याज की प्रोट?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए लिन Forlow-Jech और डैनियल लिरो धन्यवाद। इस काम यूएसडीए एआरएस के आधार क्रिस धन, राष्ट्रीय कार्यक्रम 304 द्वारा समर्थित किया गया – फसल संरक्षण और संगरोध [परियोजना # 2020-22620-022-00D] व्यापारिक नाम या व्यावसायिक उत्पादों की JAF और JJH उल्लेख करने के लिए इस लेख प्रयोजन के लिए है की विशिष्ट जानकारी प्रदान करने और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा की गई अनुशंसाओं या बेचान संकेत नहीं करता। यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है।
Materials
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
Riferimenti
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