والمستغلة نظم التعبير خلية الحشرات Nonlytic لإنتاج الخلوية الاتجار / الترجمة، والتحليل الوظيفي البروتين المؤتلف. هنا، نحن تصف وسائل لتوليد ناقلات التعبير ولاحق بروتين تعبير عابر في خطوط الخلايا حرشفية الأجنحة المتاحة تجاريا. سيعرض أيضا شارك في توطين aquaporins الذبابة البيضاء Bemisia مع البروتينات علامة فلوري التحت خلوية.
وتستخدم أنظمة بروتين تعبير مغاير لإنتاج البروتينات المؤتلف، تفسير الخلوي الاتجار / توطين، وتحديد الوظائف الكيميائية الحيوية للبروتينات في المستوى دون العضوي. على الرغم من أن أنظمة الفيروسة العصوية التعبير وتستخدم على نحو متزايد لإنتاج البروتين في العديد من التكنولوجيا الحيوية والأدوية، والتطبيقات الصناعية، وأنظمة nonlytic التي لا تنطوي عدوى فيروسية لها فوائد واضحة ولكن غالبا ما يتم التغاضي وغير المستغلة. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد ناقلات التعبير nonlytic وعابرة تعبير البروتين المؤتلف. يسمح هذا البروتوكول لتوطين الخلوية كفاءة من البروتينات المؤتلف، ويمكن استخدامها لتمييز بسرعة الاتجار البروتين داخل الخلية. نقدم لك مجموعة من التعبير عن أربعة بروتينات المؤتلف في خط خلية الحشرات المتاحة تجاريا، بما في ذلك اثنين من البروتينات aquaporin من الذبابة البيضاء Bemisia الحشرات، فضلاكما البروتينات علامة التحت خلوية محددة لغشاء الخلية البلازما والخلايا الجسيمات الحالة. تم إنتاج جميع البروتينات المؤتلف كما الوهم مع علامات بروتين فلوري في ترميني الكربوكسيل، والتي تسمح للكشف المباشر من البروتينات المؤتلف. ترنسفكأيشن مزدوج من الخلايا مع البلازميدات إيواء بنيات للجينات من الاهتمام وعلامة التحت خلوية تعرف يسمح لتصوير الخلايا الحية وتحسين التحقق من توطين البروتين الخلوي.
إنتاج البروتينات المؤتلف باستخدام نظم التعبير خلية الحشرات يقدم العديد من الفوائد لدراسة البروتينات حقيقية النواة. وهي خلايا الحشرات تمتلك تعديلات مماثلة بعد متعدية، وتجهيز، وآليات فرز مثل تلك الموجودة في خلايا الثدييات، وهو مفيد لإنتاج البروتينات مطوية بشكل صحيح 1 و 2 و 3. كما تتطلب نظم خلايا الحشرات عادة موارد أقل وأقل وقت وجهد للصيانة من خطوط الخلايا الثديية 4 و 5. نظام التعبير الفيروسة العصوية هو واحد مثل هذا النظام القائم على خلية الحشرات التي تستخدم الآن على نطاق واسع في العديد من التخصصات، بما في ذلك إنتاج البروتينات المؤتلف لتوصيف البروتين والعلاجات، وعرض مناعة من الببتيدات الخارجية والبروتينات الفيروسية لإنتاج اللقاحات، تركيب متعددة المجمعات -protein، وإنتاج البروتينات الغليكوزيلاتي، الخ. 1، 2، 4، 6. هناك، ومع ذلك، الحالات التي قد لا يكون التعبير الفيروسة العصوية ينطبق 3 و 7، واستخدام نظم التعبير الحشرات nonlytic وعابرة قد تكون أكثر ملاءمة. على وجه التحديد، عابرة التعبير خلية الحشرات توفر إمكانية لتركيب السريع للبروتين المؤتلف، ويتطلب أقل تطوير وصيانة، لا تنطوي على الفيروسية التي فرضتها تحلل الخلية، ويوفر وسيلة لدراسة أفضل الاتجار الخلوي أثناء تخليق البروتين 7، 8، 9، 10.
يصف هذا البروتوكول الجيل السريع للناقلات التعبير باستخدام خطوتين تمديد تداخل PCR (OE-PCR) <suص الطبقة = "XREF"> (11) والاستنساخ القياسية من DNA البلازميد في القولونية. يتم استخدام البلازميدات إلى المزدوج transfect خلايا الحشرات مثقف المتاحة تجاريا وتنتج البروتينات التمثيلية. يصف بروتوكول إنتاج واستخدام اثنين من البروتينات المختلفة علامة التحت خلوية fluorescently المسمى ويوضح colocalization مع اثنين من البروتينات aquaporin من الذبابة البيضاء Bemisia الحشرات. وينص البروتوكول بعد المنهجية الأساسية لOE-PCR، الحشرات صيانة الخلية وترنسفكأيشن، والفحص المجهري مضان لتوطين الخلوية من البروتينات المستهدفة.
نظم بروتين تعبير مغاير هي أدوات هامة لإنتاج البروتينات المؤتلف استخدامها في العديد من التطبيقات المصب 4. اختيار من الأنظمة التعبير المتنوعة المتاحة يعتمد على الهدف النهائي للبروتين من الفائدة. تتوفر التي تقدم بدائل مرنة لأنظمة التعبير خلية بدائية النو?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر لين Forlow-JECH ودانيال ليري للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من خلال تمويل قاعدة CRIS إلى USDA ARS، البرنامج الوطني 304 – حماية المحاصيل والحجر [مشروع # 2020-22620-022-00D] إلى JAF وJJH ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هي فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأمريكية. USDA يساوي مزود الفرصة وصاحب العمل.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |