Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen
Summary
Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.
Abstract
Heteroloog eiwit expressiesystemen worden gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, de interpretatie van cellulaire transport / lokalisatie en het vaststellen van de biochemische functie van eiwitten op sub-organismal niveau. Hoewel baculovirus expressiesystemen in toenemende mate gebruikt voor eiwitproductie in talrijke biotechnologische, farmaceutische en industriële toepassingen, nonlytic systemen die geen virale infectie inhouden duidelijke voordelen, maar vaak vergeten en onderbenut. Hier beschrijven we een werkwijze voor het nonlytic expressievectoren en transiënte expressie van recombinant eiwit. Dit protocol maakt een efficiënte cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten en kunnen worden gebruikt om snel te onderscheiden eiwittransport in de cel. We tonen de expressie van vier recombinante eiwitten in een in de handel verkrijgbaar insectencellijn, waaronder twee aquaporine eiwitten van insecten Bemisia tabaci, enals subcellulaire markereiwitten specifiek voor het cel plasmamembraan en intracellulaire lysosomen. Alle recombinante eiwitten werden geproduceerd als chimeren met fluorescerende eiwit markers aan hun carboxyl termini, die zorgt voor de directe detectie van de recombinante eiwitten. De dubbele transfectie van cellen met plasmiden constructen voor de genen van belang en een bekende subcellulaire marker zorgt voor live-cell imaging en verbeterde validatie van cellulaire eiwitten lokalisatie.
Introduction
De productie van recombinante eiwitten met behulp van expressie in insectencellen systemen biedt tal van voordelen voor de studie van eukaryotische eiwitten. Namelijk insectencellen bezitten soortgelijke posttranslationele modificaties, verwerking en sorteermechanismen als die welke in zoogdiercellen, hetgeen voordelig is voor het produceren van correct gevouwen eiwitten 1, 2, 3. Insectencel systemen ook typisch minder middelen en minder tijd en moeite voor het onderhoud dan zoogdiercellijnen 4, 5. Het baculovirus expressiesysteem is zo'n insectencellen gebaseerde systeem dat nu algemeen wordt gebruikt in vele disciplines, waaronder de productie van recombinante eiwitten voor eiwitkarakterisering en therapie, de immunogène presentatie van vreemde peptiden en virale eiwitten voor vaccinproductie, de synthese van multi -proteïne complexenDe productie van geglycosyleerde eiwitten, enz. 1, 2, 4, 6. Er zijn echter situaties waarin baculovirus expressie niet van toepassing 3, 7, en het gebruik van nonlytic en insecten transiënte expressiesystemen geschikter zijn. Bijzonder transiënte expressie in insectencellen biedt de mogelijkheid voor de snelle synthese van recombinant eiwit, vereist minder ontwikkeling en onderhoud, niet gepaard gaat met virale opgelegde cellysis en verschaft een middel om cellulaire transport beter bestuderen tijdens eiwitsynthese 7, 8, 9, 10.
Dit protocol beschrijft de snelle vorming van expressievectoren gebruikt tweestaps overlap extension PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 en de standaard klonering van plasmide DNA in Escherichia coli. Plasmiden worden gebruikt om dubbel transfecteren handel verkrijgbaar gekweekte insectencellen en representatieve eiwitten. Het protocol beschrijft de productie en het gebruik van twee verschillende fluorescent gelabelde subcellulaire markereiwitten en toont colocalisatie twee aquaporine eiwitten van het insect Bemisia tabaci. Het volgende protocol geeft de basismethode voor OE-PCR, insectencel onderhoud en transfectie en fluorescentiemicroscopie voor de cellulaire lokalisatie van doeleiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterologe eiwitexpressie zijn belangrijk voor de vervaardiging van recombinante eiwitten gebruikt in talrijke afgeleide toepassingen 4. Het kiezen van de diverse expressiesystemen beschikbaar afhankelijk van het einddoel voor het eiwit van belang. Verschillende expressie in insectencellen systemen zijn beschikbaar die flexibele alternatieven voor prokaryote en eukaryote celexpressiesystemen 5, 6 te bieden. Insecten systemen die baculovir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Lynn Forlow-Jech en Dannialle LeRoy voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door base CRIS financiering van USDA ARS, Nationaal Programma 304 – Crop Protection and Quarantine [Project # 2020-22620-022-00D] om JAF en JJH Vermelding van handelsnamen of commerciële producten die in dit artikel is alleen voor het doel van het verstrekken van specifieke informatie en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.
Materials
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
Riferimenti
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. , 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
